Name: phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos
Uploaded: 2017-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

Onların tavsiyeleri için Kaz Nagaosa ve Akiko Shiratsuchi&#39;ye minnettarız.

1. Hazırlık <ol><li> Taze üzüm suyu agar plakalarının hazırlanması <ol><li> 4.4 g agarda 100 mL su ilave edin ve karışımı mikrodalga fırında ısıtarak agarı çözün. </li><li> 80 mL taze üzüm suyu, 5 mL asetik asit ve 5 mL etanol, agar solüsyonuna ilave edin. </li><li> Her cam slayt üzerine bir pipet ile yaklaşık 1.5 mL çözelti dökün ve katılaşmasına izin verin. </li></ol></li><li> 6 cm çanak agaroz plakalarının hazırlanması <ol><li> 0.5 g agaroza 50 mL su ilave edin ve agarozu çözmek için mikrodalga fırında ısıtın. </li><li> Bir pipet ile 6 cm&#39;lik bir tabağa yaklaşık 2.5 mL agaroz çözeltisi dökün. </li></ol></li></ol> 2. Evre 16 Embriyo Koleksiyonu <ol><li> Yetişkin sinekler toplayın ve 200 mL dişiler ve 200 erkek bir 50 mL konik tüp ekleyin. </li><li> Maya üzerine taze üzüm suyu agarı bir tabak 50 mL tüp içine koyun ve bir sünger cas. </li><li> Sinekleri ışık altında 16 ° C&#39;de 2 - 3 gün inkübe edin. Plakayı günde bir kez değiştirin. </li><li> Sinekleri karanlıkta 25 ° C&#39;de 1 saat hareket ettirin. </li><li> Eski tabağı mayasız yeni bir tabakaya değiştirin. Uçaklara 2 saat yumurta bırakmasına izin ver. </li><li> Plakayı toplayın ve 16 saat boyunca inkübe edin. 26 saat süreyle inkübe edin. </li><li> % 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren 1 mL PBS içine bir boya fırçası ile plakadan embriyolar toplayın. </li><li> Embriyoları,% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren 1 mL PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Porsiyonu çıkartmak için, 3 dakika embriyoya 1.2 mL sodyum hipoklorit çözeltisi (% 2.2 - 3.4 Cl) ekleyin. </li><li> Embriyoları,% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren 1 mL PBS ile 4 kez yıkayın. </li><li> 6 cm çanak agaroz plakaları embriyolar yerleştirin. Evre 16 embriyoları, Roberts 20 tarafından tarif edildiği gibi mikroskop altında alın. Bir mikropipet ile 1.5 mL&#39;lik bir Treff mikro test tüpünde yaklaşık 50 embriyo toplayın. </li></ol> 3. PrepaEmbriyonik Hücrelerin Rasyonları <ol><li> Embriyoları iki kez 150 μL PBS ile yıkayın. </li><li> PBS içinde kollajenaz 200 uL (% 0.25 (w / v)) varlığında embriyoları 1.5 mL mikro test tüpü ve pelet mikserinde 30 kez homojenize edin. </li><li> Embriyonik hücreleri 10 kez pipetle dağıtın ve hücre süspansiyonunu 1.5 mL tüp içine alın. Hücreleri 37 ° C&#39;de 1 dakika su banyosunda inkübe edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın. </li><li> Hücre süspansiyonuna 800 μL PBS ekleyin ve 4 ° C&#39;de 1400 x g&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı çıkarın ve hücrelere PBS içinde 200 μL tripsin (% 0.25 (w / v)) ekleyin. Embriyonik hücreleri 50 kez pipetle dağıtın. </li><li> Hücre süspansiyonunu 70 um&#39;lik bir Hücre Süzücü ile süzün. </li><li> Tripsin aktivitesini durdurmak için filtrelenmiş hücre süspansiyonuna 40 μL ısı ile inaktive fetal sığır serumu ekleyin. 800 μL PBS ekleyin ve 4 ° C&#39;de 1,400 x g&#39;de 5 dakika süreyle santrifüjleyin. </li><li> Supernata&#39;yı kaldırNt, 200 ul PBS içinde çökelen hücreleri askıya alın ve 1400 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı çıkarın ve 30 uL PBS içinde çökelen hücreleri bekletin. </li><li> Hazırlanan hücre süspansiyonunu aminopropil trietoksisilan kaplı cam slaytlara monte edin ve hücreler cam slaytlara tutturuncaya kadar 10-15 dakika bekleyin. </li><li> Cam slaytlardaki kalan çözeltiyi bir pipetle çıkarın. Tespit için 10-15 dakika boyunca hücrelere% 4 (w / v) PFA (paraformaldehid) içeren PBS&#39;nin 60 - 70 μL&#39;sini monte edin. </li><li> Sabitleme çözeltisini çıkarın ve 1 dakikadan fazla cam kaydırıcıları PBS&#39;ye yerleştirin. </li></ol> 4. Hemocytes Boyama <ol><li> Bir anti-Croquemort antikoru ile immün boyama <ol><li> 10 dakika boyunca% 0,2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde ve sonra 10 dakika boyunca PBS&#39;de, 10 dakika boyunca metanol içinde cam kaydırıcıları ıslatınız. </li><li> PBS içerisinde 20 μL% 5 (v / v) tam domuz serumuEngelleme hücreleri üzerinde% 0.2 (v / v) Triton X-100. Slaytları 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Çözeltiyi cam kaydıraklardan çıkarın ve hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde 20 μL anti-Croquemort antiserumu 19 , 21 (% 0.1 (v / v)) yerleştirin. Slaytları gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin. </li><li> Cam kaydırakları 10 dakika PBS&#39;de bekletin. </li><li> Odalarda hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 ve% 5 (v / v) bütün domuz serumunu içeren PBS içinde 20 uL alkalin fosfataz etiketli anti-sıçan IgG&#39;si (% 0.5 v / v) Sıcaklık 1 saat. </li><li> 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin. </li><li> 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl ihtiva eden tampon içinde cam slaytlar ıslatın ve 10 dakika için 50 mM MgCl2. </li><li> 0.23 mg / mL 5-bromo-4 içeren dağ fosfataz substrat çözeltisi-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP), 0.35 mg / mL nitrotetrazolivm (NBT), 100 mM Tris-HCI, pH 9.5, 100 mM NaCI, ve hücreler 50 mM MgCl2. </li><li> Düzgün boyanması için hücreleri mikroskop altında izleyin. Hemocytes granüllerinde güçlü mor sinyalleri göründüğünde, substrat solüsyonu çıkarın ve 10 mM Tris-HC1, pH 8.5 ve 1 mM EDTA içeren tampon cam slaytlar batırın. Yaklaşık 5 - 10 dakika boyanması önerilir. </li></ol></li><li> Bir anti-GFP antikoru ile immün boyama (hemositlerin boyanması için başka bir seçenek) <ol><li> Cam kaydırakları 10 dakika süreyle metanol içinde, 10 dakika için% 0.2 (v / v) Triton X-100 ve 10 dakika PBS içeren PBS&#39;yi ıslatınız. </li><li> Blokaj için hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde% 5 (v / v) tam domuz serumu 20 uL&#39;lik bir miktarı monte edin. Slaytları 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Cam slaytlardaki çözeltiyi çıkarın ve 20 μL fare anti-GFP antikoru (% 1 (v / v)) / PBS cHücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 ile ulaşılmaktadır. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin. </li><li> Cam kaydırakları 10 dakika PBS&#39;de bekletin. </li><li> Odalarda hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 ve% 5 (v / v) tüm domuz serumu içeren PBS&#39;de 20 uL alkalin fosfataz etiketli anti-fare IgG&#39;si (% 0.5 v / v) Sıcaklık 1 saat. </li><li> 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin. </li><li> 100 mM Tris-HCI, pH 9.5, 100 mM NaCl&#39;den oluşan tampon içinde cam slaytlar ıslatın ve 10 dakika için 50 mM MgCl2. </li><li> 0.23 mg / ml BCIP, 0.35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCI, ve hücreler 50 mM MgCl2 ihtiva eden fosfataz alt-tabaka çözeltisi monte edin. </li><li> Düzgün boyanması için hücreleri mikroskop altında izleyin. Tam hemositlerde mor sinyaller göründüğünde, substrat solüsyonunu çıkarın ve içindeki slaytları,10 mM Tris-HC1, pH 8.5 ve 1 mM EDTA. Yaklaşık 10-15 dakika boyanması önerilir. </li></ol></li></ol> 5. TUNEL tarafından Apoptotik Hücrelerin Boyanması <ol><li> Cam kaydırakları 5 dakika PBS&#39;de bekletin. </li><li> Yeni PBS ile tekrarlayın. </li><li> Dengeleyici dengeleyici tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) 10 dakika boyunca hücrelerde. </li><li> Cam slaytlar solüsyonu kaldırın ve 1 saat 37 ° C&#39;de hücrelere 15 uL Reaksiyon Tamponu ve terminal deoksinükleotidil transferaz 5 mcL içeren TdT çözeltisi 20 mcL monte edin. </li><li> Çözeltiyi cam kaydıraklardan çıkarın ve slaytları 0.5 mL STOP / Yıkama tamponu ve 17 mL sudan oluşan tampona batırın. </li><li> Slaytları PBS içinde 5 dakika 3 kez bekletin. </li><li> 30 dk boyunca oda sıcaklığında hücrelere 20 μL Anti-Digoxigenin-Peroksidaz ekleyin. </li><li> Cam kaydırakları 5 dakika 4 kez PBS&#39;de bekletin. </li><li> Cam slaytları 30 mL 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 suşu içeren peroksidaz substrat çözeltisine batırın30 sn için 3,3&#39;-diaminobenzidin tetrahydrichloride (DAB) ve% 0.002 (h / h) H2 O 2 ga tam mikro spatula. </li><li> Apoptotik hücreler kahverengi oluncaya dek adım 5.9&#39;u tekrarlayın. Peroksidaz reaksiyonunu durdurmak için cam kaydırıcıları suya batırın. </li><li> Gözlem için hücreleri su ile kapatın. </li></ol> 6. Apoptotik Hücrelerin Fagositoz Düzeyini ölçün <ol><li> Fagositoz düzeyini değerlendirmek için örnekleri hafif bir mikroskopta izleyin. Hemocytes olarak Croquemort pozitif hücreleri veya GFP pozitif hücreleri, Apoptotik hücreler olarak TUNEL pozitif hücreleri ve hemositleri fagositize eden çift pozitif hücreleri sayın. </li><li> Fagositik indeks, Croquemort pozitif hücrelerin veya GFP pozitif hücrelerin toplam sayısına karşı çift pozitif hücre sayısı olarak tanımlanır. 300&#39;den fazla hemosit izlenmesi önerilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116 (2), 205-219 (2004).</li><li>Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+development.">Cell death in development.</a> Cell. 96 (2), 245-254 (1999).</li><li>Savill, J., Fadok, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corpse+clearance+defines+the+meaning+of+cell+death.">Corpse clearance defines the meaning of cell death.</a> Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).</li><li>Ravichandran, K. S., Lorenz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells:+signals+for+a+good+meal.">Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal.</a> Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beginnings+of+a+good+apoptotic+meal:+the+find-me+and+eat-me+signaling+pathways.">Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways.</a> Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).</li><li>Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+removal+of+cells+that+have+become+unwanted:+implications+for+animal+development+and+tissue+homeostasis.">Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis.</a> Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).</li><li>Reddien, P. W., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+engulfment+process+of+programmed+cell+death+in+caenorhabditis+elegans.">The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).</li><li>Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+programmed+cell+deaths+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).</li><li>Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+the+engulfment+of+cell+corpses+during+programmed+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).</li><li>Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CED-12/ELMO,+a+novel+member+of+the+CrkII/Dock180/Rac+pathway,+is+required+for+phagocytosis+and+cell+migration.">CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration.</a> Cell. 107 (1), 27-41 (2001).</li><li>Hsu, T. Y., Wu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells+in+C.+elegans+is+mediated+by+integrin+alpha/SRC+signaling.">Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling.</a> Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+factor+that+links+apoptotic+cells+to+phagocytes.">Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.</a> Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).</li><li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+cellular+immunity+in+Drosophila+melanogaster.">Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster.</a> Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).</li><li>Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+during+Drosophila+embryogenesis.">Programmed cell death during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 117 (1), 29-43 (1993).</li><li>Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+croquemort+in+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).</li><li>Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+innate+immunity+in+Drosophila+by+endogenous+chromosomal+DNA+that+escaped+apoptotic+degradation.">Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation.</a> Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).</li><li>Manaka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draper-mediated+and+phosphatidylserine-independent+phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+Drosophila+hemocytes/macrophages.">Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages.</a> J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 3868-3878 (1998).</li><li>Kuraishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretaporter,+a+Drosophila+protein+serving+as+a+ligand+for+Draper+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+cells.">Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells.</a> Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).</li><li>Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Croquemort,+a+novel+Drosophila+hemocyte/macrophage+receptor+that+recognizes+apoptotic+cells.">Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells.</a> Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).</li><li>Kuraishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+calreticulin+as+a+marker+for+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).</li><li>Nagaosa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila+embryos.">Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos.</a> J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).</li><li>Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alphaPS3/betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+and+bacteria+in+Drosophila.">Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila.</a> J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).</li><li>Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NPxY+motif+in+Draper-mediated+apoptotic+cell+clearance+in+Drosophila.">Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila.</a> Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).</li><li>Bruckner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Pathway+for+Phagocyte+Priming+upon+Encounter+with+Apoptotic+Cells.">Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells.</a> J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+disease+and+impaired+uptake+of+apoptotic+cells+in+MFG-E8-deficient+mice.">Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice.</a> Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

<html> Burada, Drosophila embriyolarını kullanan bir fagositoz tahlili tarif ettik. Fagositozu niceliksel olarak ölçmek için dağınık embriyonik hücreler kullanarak Hemocytes, Drosophila professional phagocytes, Hemocyte marker Croquemort veya srpHemo- kaynaklı GFP için immünostained ve apoptotik hücreler bu protokolde TUNEL tarafından tespit edilir. Fagositoz seviyesi, hemositlerin ve fagosit oksitleyici hemositlerin toplam sayısını sayarak bir fagositik indeks olarak ifade edi...

Metazoan hayvanlarda, örneğin nematod Caenorhabditis elegans , meyve sinek Drosophila melanogaster ve fare ve insanlar, çok sayıda hücre vücutlarını şekillendirmek için gelişme döneminde ve erişkinlikte homeostazı 1 , 2 korumak için apoptoz geçirir. Apoptotik hücrelerin hızla çıkartılması gerekir çünkü bunlar, tamamen çıkarılmasa bile, immünojenik hücre içi materyalleri serbest bırakarak çevreleyen dokularda iltihap oluştururlar 3 . Hızlı kaldırmayı kolaylaştırmak için, apoptotik hücreler, fagositlerin yutulma reseptörleri tarafından tanınan ve yememe sinyalleri olarak adlandırılırlar ve fagositoz 3 , 4 , 5 , 6 ile ortadan kaldırılırlar. Böylece, fagositoz ana homeostazın korunmasında hayati bir rol oynar ve bu nedenle molekülün aydınlatılması<html> Apoptotik hücrelerin fagositozunun altında yatan mekanizmalar önemlidir. Apoptotik hücrelerin fagositozundan sorumlu mekanizmalar, nematodlar, sinekler ve farelerdeki türler arasında evrimsel olarak korunmuş gibi gözükmektedir 7 . Bu model hayvanların apoptotik hücrelerin soğumasını değerlendirmek için çeşitli fagositoz testleri mevcuttur. C. elegans içinde, 131 somatik hücre gelişimi sırasında programlanmış hücre ölümü ve hücre cesetleri profesyonel olmayan fagositler 8 olan komşu hücreler tarafından fagosite edilen. Böylece, C. elegans&#39;taki kalan hücre cesetlerinin sayısının sayılması, in vivo fagositoz seviyesini gösterir. Ölü hücrelerin artan sayısını gösteren nematod mutantlarını araştırarak, fagositoz için gereken birkaç gen tespit edildi ve genetik olarak 9 , 10 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Birincil kültür fagositleri (genellikle makrofajlar) ile ex vivo fagositoz testleri, farelerde sıklıkla kullanılır. Apoptotik hücreler, Jurkat hücreleri gibi hücre hatları kullanılarak hazırlanır ve primer fagositlerle karıştırılır. Birkaç saat inkübasyondan sonra fagositoz seviyesini değerlendirmek için toplam fagosit sayısı ve sindirim fagosit sayısı hesaplanır. Bu yöntemin sofistike bir modifikasyonu olan Nagata&#39;nın grubu, apoptotik hücrelerin apoptotik DNA fragmantasyonuna maruz kalmadığı, ancak kaspaza dirençli bir ICAD (kaspazla aktive DNaz inhibitörü) eksprese eden hücrelerle ex vivo fagositoz testi geliştirdi; ancak DNA hala kesildiğinde Hücreler fagositozlanır. Bu hücreler, bir fagositoz tahlilinde apoptotik hedefler olarak kullanıldığında, sadece sarmalanmış apoptotik hücrelerin DNA&#39;sı parçalanır ve TdT aracılı dUTP nick uç etiketlemesi (TUNEL) ile boyanır. Bu nedenle, leveL apoptotik hücre yutulması, bir fagosit ve apoptotik hücre karışımı 13 içinde TUNEL sinyallerinin sayılmasıyla ölçülür. D. melanogaster&#39;da , hemocytes adında profesyonel fagositler, Drosophila makrofajları, 14 , 15 apoptotik hücrelerin fagositozundan sorumludur. Kültür hücresi soyları ile yapılan in vitro fagositoz analizlerine ek olarak , bütün Drosophila embriyolarıyla in vivo fagositoz analizleri mevcuttur. Drosophila embriyolar birçok hücreleri apoptozise uğrar ve embriyonik gelişim 14, 15, 16 boyunca hemocytes tarafından fagosite edilir çünkü apoptotik hücre yutulma seviyesinin incelenmesine yönelik güçlü bir araçtır. Bir in vivo fagositoz tahliline bir örnek, Franc&#39;in grubu tarafından geliştirilen yöntemdir. Yöntemlerinde hemositler deBir hemosit işareti olan peroksidazenin immüno-lekelemesi ile tespit edilen apoptotik hücreler, bütün Drosophila embriyolarında 7-amino aktinomisin D nükleer boya kullanılarak lekelenmiş ve çift pozitif hücrelerin sayısı, fagositoz 17 sinyali olarak sayılmıştır. Embriyolarda bir fagositoz tahlili için bir başka örnek, yukarıda tarif edilen Nagata metodu kavramına dayanır; Bununla birlikte, in vivo fagositoz, dCAD ( Drosophila caspase-activated DNase) mutant sinekler 18 , 19&#39;un embriyoları kullanılarak değerlendirilir. Bu in vivo fagositoz testleri doğrudan in situ fagositoz gözlemlemek için yararlıdır. Bununla birlikte, zorluklar, fagosit hücrelerini sayma aşamasındaki muhtemel yanlılıkların hariç tutulması ile ilişkilidir; çünkü kalınlığından ötürü bütün embriyoların tüm fagositlerini ve apoptotik hücrelerini gözlemlemek zordur. Bu kısıtlamanın üstesinden gelmek için,Drosophila embriyolarında yeni bir fagositoz testi yaptı. Yöntemimizde, fagositozan hemositleri kolayca sayabilmek için, bütün embriyolar dağınık embriyonik hücreleri hazırlamak için homojenize edilir. Fagositler, bir fagosit markörünün immün boyaması ile tespit edilir ve apoptotik hücreler, bu dağınık embriyonik hücreler ile TUNEL tarafından saptanır. Dağıtılan embriyonik hücrelerin kullanılması, in vivo fagositoz düzeylerini, fagositoz düzeyini tam olarak ölçen bir in vitro fagositoz tahlilini gerçekleştirmiş gibi ölçmenizi sağlar. Bunlar embriyo 20 16 fagositozla olan apoptotik hücre mesafesi en bol gelişimsel aşama aşama için gelişirse sinekler tüm genotipler Bu deneyde kullanılabilir. Bu yöntem, fagositoz seviyesini kantitatif olarak değerlendirmenin avantajına sahiptir ve bu nedenle apoptotik hücrelerin in vivo fagositozunda yer alan yeni moleküllerin tanımlanmasına katkıda bulunabilir.

<table><tbody><tr><td>whole swine serum</td><td>MP Biomedicals</td><td>55993</td><td>For bloking</td></tr><tr><td>Treff micro test tube(easy fit)&amp;nbsp; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 4625. 9. 01</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>pellet mixer&amp;nbsp; 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 7339. 9. 03</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td><td>27250-018</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td><td>KPL</td><td>475-1612</td><td>secondary antibody for&lt;br/&gt; stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-&lt;br/&gt; 3-indolyl-phosphate</td><td>Roche</td><td>11383221001</td><td>BCIP, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>nitro blue tetrazolium</td><td>Roche</td><td>11383213001</td><td>NBT, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Anti-Croquemort antibody</td><td></td><td></td><td>described previously in Manaka &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Anti-GFP&lt;br/&gt; from mouse IgG1&amp;kappa; (clones 7.1 and 13.1)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6520</td><td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine&lt;br/&gt; tetrahydrichloride</td><td>nacalai tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table of Fly Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock center&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock ID&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Control flies, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>drpr&lt;sup&gt;&amp;Delta;5&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>drpr mutant, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>Itgbn&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Itgbn mutant, described in Devenport &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Development, 131, 5405-5415</td></tr><tr><td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td><td></td><td></td><td>described in Br&amp;uuml;ckner &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Dev. Cell., 7, 73-84</td></tr><tr><td>UAS-drpr-IR</td><td>VDRC</td><td>4833</td><td>-</td></tr><tr><td>UAS-Itgbn-IR</td><td>NIG-fly</td><td>1762R-1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

Apoptotik hücrelerin fagositozunun altında yatan moleküler mekanizmalar, bağışıklık ve inflamatuar dirençli hastalıklarda rolünden dolayı daha ayrıntılı olarak açıklığa kavuşturulmalıdır. Burada, fide soğurumunu kontrol eden gen şebekesinin memelilerden evrimsel olarak korunduğu Drosophila meyve sineği kullanılarak kantitatif olarak fagositozu araştırmak için deneysel bir yöntem geliştirdik. Tam hayvanlar kullanılarak engulfing ve un-engulfing fagositleri doğru tespit etmek ve saymak için Drosophila embriyoları, fagositler ve apoptotik hücreler de dahil olmak üzere dağılmış hücreler elde etmek üzere homojenize edildi. Dağıtılmış embriyonik hücrelerin kullanımı, in vitro fagositoz düzeylerini, bütün embriyolardaki tüm fagositleri ve apoptotik hücreleri gözlemlemek ve fagositoz düzeyini tam olarak ölçmek mümkün olan bir in vitro fagositoz tahlilini gerçekleştirmiş gibi ölçebilir. Bu yöntemin daha önceki çalışmaların yöntemlerini ürettiğini doğruladıkBu, apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli genleri belirledi. Bu yöntem, ölü hücrelerin parçalanmasını sağlar ve Drosophila&#39;nın güçlü genetiği ile birleştirildiğinde, fagositler tarafından apoptotik hücrelerin migrasyonu, tanınması, yutulması ve parçalanması ile oluşan karmaşık fagositik reaksiyonları ortaya çıkaracaktır.

Apoptotik hücrelerin fagositozunu incelemek amacıyla gelişim aşaması 16&#39;nın Drosophila embriyoları toplandı ve dağılmış hücreler olarak hazırlandı. Hemocytes, Drosophila makrofajları, hemocyte marker &quot;Croquemort&quot; 17 , 22 için immünositokimya ile spesifik bir antikor 19 , 21 kullanarak lekelenmiş ve apoptotik hücreler da?...

Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Drosophila&#39;nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi<em&gt; Drosophila</emEmbriyolar

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

phagocytosis-assay-for-apoptotic-cells-in-drosophila-embryos

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

9.8K Görüntüleme.  Kanazawa University.  Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır. 

Video: Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Nörobilim

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Tıp

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Biyoloji

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

An In Vivo Assay to Quantify Bacterial Phagocytosis in Adult Drosophila Flies

Source: Nazario-Toole, A. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59543">Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an in vivo assay designed to measure bacterial phagocytosis in adult Drosophila flies. Following the injection of fluorescently labeled bacteria into the abdomen of adult flies, hemocytes associated with the dorsal vessel engage in phagocytosis. The introduction of trypan blue dye serves to quench the fluorescence emitted by extracellular, non-phagocytosed bacteria. This quenching process enhances the identification of phagocytosed bacteria when observed under a fluorescence microscope.

Yetişkin Drosophila Sineklerinde Bakteriyel Fagositozu Ölçmek için İn Vivo Bir Test

1. Prepare Fluorescein particles for injection

	Reconstitute 10 mg of commercially available, heat-killed bacteria particles labeled with fluorescein ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Görüntüleme ve Görselleştirme Teknikleri

The Phagocytosis Assay: An Immunostaining Technique to Visualize Apoptotic Cell Engulfment in the Embryonic Cells of Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. <a href="https://app.jove.com/v/56352">Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining technique to visualize apoptotic cell engulfment in the homogenized embryonic cells of Drosophila melanogaster. This method provides insights into cellular physiology by determining the extent of apoptotic cell engulfment.

Fagositoz Testi: Drosophila melanogaster'in Embriyonik Hücrelerinde Apoptotik Hücre Yutulmasını Görselleştirmek İçin Bir İmmün Boyama Tekniği

Source: Nonaka, S. et al. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining ...

Biyolojik Teknikler

Tahlil Teknikleri

Hücre bazlı analizler

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

Source: Taruc, K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58149">Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

Sabit Hücreli Efferositoz Deneyi: Floresan Mikroskobu Kullanarak Apoptotik Hücrelerin Makrofajlar Tarafından Efferositik Alımını İncelemek İçin Bir Yöntem

Source: Taruc, K., et al. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler