MCherry ifade Coxiella burnetiistokları sağlamak için Dr Robert Heinzen için minnettarız. Biz Dr Luis Teixeira omurgasız yanardöner virüs 6 ve Bloomington stok merkezi sinek stokları sağlamak için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu projenin kısmen NIH hibe R00 AI106963 (A.G.G.) ve Washington State Üniversitesi tarafından finanse edildi.

1. ex vivo enfeksiyon
<ol><li>Orta ve donanımları<ol>
<li>Steril koşullarda, taze Drosophila Hemocyte izole Orta (% 75 Schneider'ın Drosophila içeren DHIM) hazırlamak orta % 25 ile Fetal sığır Serum (FBS) ve filtre bu sterilize.</li>
		<li>2-3 adet 10 cm x 10 cm parafin film bir stereomicroscope altında katman.</li>
		<li>Cam kılcal hazırlayın. Kapiller çektirme ısıtıcı maksimum % 55'i için ayarlayın. Kılcal tüp yaklaşık 10 µm keskin bir noktaya kadar çekin.</li>
		<li>Mineral yağ ile kılcal tamamlanmıyor.</li>
		<li>Dolu kılcal tüp nanoinjector (Şekil 1A) üzerine monte ve erimiş kılcal tüp İpucu İpucu off forseps ile (Şekil 1B) kırarak açık. Ucu dış çapı hemocytes kolay alımını için 100 µm olmalıdır.</li>
		<li>Kılcal tüp ucundan mümkün olduğunca çok yağ çıkarma sonra DHIM ile doldurun. Kenarlığı yukarı çekilen hemolymph ve yağ ile kolay görselleştirme için petrol ve DHIM arasında bir hava kabarcığı şunlardır (Şekil 1B').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph ayıklama<ol>
<li>Al 3rd biçim Drosophila larva iç duvar gıda yavaşça forseps kullanarak tüp ve bir 100 µm süzgeç (Şekil 1C) koyun. 3rd INSTAR larvalar 3-6 gün yetişkin bir kadın tarafından döşeme verimli yumurta bulunur. Not: Bu deneyler genotip, w1118kullanılan; P {w+ mCHml-GAL4.Δ =} 2, P {w+ mCUAS-2xEGFP =} AH2 beri hemocytes bu hayvanlardan gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) mikroskopi tarafından hücreleri tanımlaması içinde yardım etmek için hızlı.</li>
		<li>Larvaları 5 mL steril su dökün ve aşırı su kaldırmak 5 s. yer için görev silme üzerine süzgeç Süzgeç sallamak (Şekil 1C').</li>
		<li>Larvalar 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Onları CO2 gaz için 5 ile anestezi s (Şekil 1D).</li>
		<li>Parafin filmi stereomicroscope altında üzerine larva dorsal yüzü (Şekil 2A) bakacak şekilde yerleştirin.</li>
		<li>Yere tutun ve posterior kütikül bozmak için yer cam larva arka gövde üzerine hafifçe kapiller ince sivri uçlu forseps (Şekil 2B) kullanarak açın.</li>
		<li>Parafin filmin (Şekil 2C) akmaya hemolymph izin verir.</li>
		<li>Parafin film üzerinde bir anda hemocytes 20-50 larvaları üzerinden de dahil olmak üzere hemolymph bir havuz yapmak.</li>
		<li>Cam kullanarak havuza alınan hemolymph kadar nanoinjector (resim 2D) kapiller al. Not: Hemolymph, yaklaşık 10-20 µL olmalıdır.</li>
		<li>Hemolymph DHIM (Şekil 2E) 500 µL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüp çıkar.</li>
		<li>Adımları yineleyin 1.2.4) - 1.2.9 yükleme) larva her dizi için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemocytes saymak.<ol>
<li>5 µL % 0,4 Trypan mavi çözüm ölü hücreleri leke 0.6 mL microcentrifuge tüp içinde pipet. Hafifçe DHIM ve hemocytes bir pipet kullanarak 1,5 mL tüp içinde karıştırın ve DHIM 0.6 mL microcentrifuge Tube hemocytes de dahil olmak üzere 5 µL aktarmak ve karışımı yavaşça.</li>
		<li>11: Trypan mavi: hemocyte karışımı hücre 10 µL hemasitometre pipet.</li>
		<li>Trypan ile değil lekeli hemocytomter 4 köşe alanların her birinde mavi ve hemocytes formülünü kullanarak mililitre başına konsantrasyonu hesaplayan canlı hemocytes saymak: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> Burada X mililitre başına canlı hemocytes konsantrasyonu ise; a, b, c ve d mı hemasitometre içinde sayılan alanların her 4 canlı hücrelerde (Trypan mavi dışlama tarafından belirlenen) sayısı. 1:1 seyreltme Trypan mavi içeren hücrelerin hücre sayılan toplam sayısı 2 ile bölme kaynaklanmaktadır. Trypan ile mavi lekeli hücreleri ölü kabul edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ex vivo Enfeksiyonlar<ol>
<li>Kuyu timepoints ve biyolojik dayalı hücreleri ile seribaşı sayısını çoğaltır her deneme için gerekli belirlemek. 5.0 × 104 hemocytes enfeksiyonu takip RNA ve protein arıtma için arzu.</li>
		<li>DHIM ile enfeksiyon için aşağıdaki formülü kullanarak seyreltilmiş için patojen stok hacmi hesaplamak: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> nerede enfeksiyon (MOI) çokluğu veya bakteri hücre başına istenen viral sayısıdır. Not: kullanılan MOI bireysel deney ve deneyleri gerçekleştirilen bağlıdır. Burada, 10 genom eşdeğerleri (GE) / C. burnetii, 10 CFU/hücrenin Listeriaveya 1 TCID50/cell IIV6, hücresi kullanıldı.</li>
		<li>500 µL patojen orta bir tüp viral veya bakteriyel cilt DHIM uygun hacmi ekleyerek bir 24-şey plaka her şey için hazır olun.</li>
		<li>Yer 12 mm yuvarlak cam (No 1 kalınlık) 24-şey kalıbının kuyuya.</li>
		<li>Hemocytes 24-şey plaka kuyu dahil DHIM bölme.</li>
		<li>500 µL patojen orta hemocytes bir kuyu içinde ekleyin.</li>
		<li>1000 x g 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>28 ° C'de 1 h plaka kuluçkaya Her 15 dk, hafifçe açık, daha sonra soldan sağa 5 arka plakasına eğimli el tarafından s.</li>
		<li>1 h işgali/ek adım 1.4.8) sonra yavaşça patojen orta pipet hemocytes taze DHIM ile yıkayın ve taze DHIM 500 µL ile doldurma.</li>
		<li>Virüslü hemocytes için istenen saat kuluçkaya. Bu deneylerde, C. burnetii- veya hemocytes IIV6 enfekte inkübe 24 h ve Listeriaiçin-virüslü hemocytes inkübe 1, 2 veya 4 h için.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. vivo enfeksiyon
<ol><li>Enfeksiyon<ol>
<li>Drosophila meyve suyu agar tabağı 15 dk. plakaları için oda sıcaklığında daha önce yapılan sıcak20nitelendirdi.<ol>
<li>30 g agar 700 mL su ve basınçlı kap ekleyin 40 dk için.</li>
			<li>Metil paraben mutlak etanol 10 ml 0.5 g geçiyoruz.</li>
			<li>Metil paraben çözüm için 300 mL meyve suyu konsantresi ekleyin.</li>
			<li>Hızlı bir şekilde suyu konsantresi autoclaved agar çözüm mix ve 5 mL 10 × 35 mm Petri yemekleri dağıtmak.</li>
			<li>Tabakları 15dk için soğutmalı sonra onları 4 ° C'de depolayın</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hazırlamak 3rd INSTAR larva aşağıdaki adımları 1.2.1) - 1.2.3).</li>
		<li>Maya Yapıştır bir agar tabağa yerleştirin. Nerede larva (Şekil 3A) kurutma önlemek için geçirebilirsiniz agar plaka iyi bir kesim yapmak. Parafin film (Şekil 3B, C) kullanarak forseps holding ile 0,001 mm sivri tungsten iğne bir araya getirin.</li>
		<li>Yüksek-titresi mCherry 50 µL pipet ifade -C. burnetii (5,95 × 109 GE/mL) parafin üzerine film stereo mikroskop altında ve larvalar bakteri havuzun yerleştirin.</li>
		<li>Larvalar bakteri havuzun yerleştirin. Larva (Şekil 3D) tungsten iğne ile dikmek. Larvalar agar plaka (Şekil 3E) üzerine aktarın.</li>
		<li>Agar plaka kalan patojen ortamına aktarmak ve parafin film ile plaka mühür.</li>
		<li>Larvalar plaka üzerinde istenen saat sonrası enfeksiyon (Şekil 3F) kadar nemli havada tut. Bu deneyde, C. burnetii-virüslü larvaları vardır 24 h için plaka üzerinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph çıkarma ve hemocytes kaplama<ol>
<li>Orta ve 1.1. adımda takip donanımları hazırlamak).</li>
		<li>Yer 12 mm yuvarlak cam (No 1 kalınlık) 24-şey kalıbının kuyuya. DHIM 500 µL kuyunun içine pipet.</li>
		<li>Hemolymph aşağıdaki adımları 1.2.4 virüslü larvaları özü) - 1.2.8).</li>
		<li>Hemolymph de aşağıdaki içine çıkarma adım 2.2.2).</li>
		<li>2.2.3 tekrar) ve 2.2.4) larva, birden çok toplu işlem için.</li>
		<li>1000 x g 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. görsel öğe
<ol><li>Sabitleme ve boyama<ol>
<li>Hemocytes iyi yuvarlak kapak camına yerleşmek izin sonra yavaşça orta her kuyudan çıkarın.</li>
		<li>Yavaşça 200 µL % 4 paraformaldehyde (PFA), kapatılan hemocytes her şey için ekleyin. Hemocytes oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>%4 kaldırmak PFA ve yavaşça 200 µL % 0,1 içeren PBS ekleyin Triton X-100 ve %1 sığır Serum Albumin (BSA) her şey için. Hemocytes oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>PBS kaldır ve yavaşça, 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) her şey için 200 µL ekleyin. Hemocytes içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>DAPI çözümü kaldırmak ve yavaşça her şey için PBS ekleyin. Hemocytes oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Antifade montaj orta 10 µL cam mikroskop slayt üzerinde bırakın.</li>
		<li>PBS her kuyudan kaldırdıktan sonra kapak cam 24-şey plaka ince sivri uçlu forseps kullanarak kaldırın. Yavaşça kapak cam antifade montaj ortama cam slayt üzerinde hemocytes aşağı bakacak şekilde yerleştirin.</li>
		<li>Karanlık gecede yerleştirerek kurumaya slayt izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocal görüntüleme<ol>
<li>Üç renk görüntüleme DAPI, EGFP ve mCherry için confocal mikroskop yapılandırın. Aşağıdaki ayarı kullanın: DAPI uyarma (ex) 405 nm, emisyon (em) 415-480 nm; EGFP 488 ex nm, em 493-564 nm; mCherry 587 ex nm, em 597-700 nm.</li>
		<li>Mikroskop ve odak bir 63 X kullanarak örnek örnek yerleştirin / 1.4 sayısal diyafram (NA) amaç. İstenen hemocytes görüntüleme için görüş alanı bulun.</li>
		<li>Lazer güç ve dedektör kazançlar örnek uygun pozlama elde etmek için ayarlayın. Birden çok z-düzlem pozlama seviyesi tüm örnek kalınlığı için uygun olduğundan emin olmak için denetleyin.</li>
		<li>Bütün hemocyte z ekseni üzerinde üst ve alt konumu bulun. Bu pozisyonlar z kesit için başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlayın.</li>
		<li>Sadece görüntü hemocyte bulunduğu alanı için tarama zoom özelliğini kullanın. 3 X Zoom faktörleri genellikle kullanılır.</li>
		<li>1024 x 1024 piksel x-y düzlemde gibi uygun çözünürlükte görüntü serisi ve 0.3 µm Aralık z boyut toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D modeli yeniden yapılanma Not: Açık kaynak yazılım 3D modeli yeniden yapılanma için aşağıda açıklanan işlevlerin çoğunu gerçekleştiren oluşur.<ol>
<li>Z kesitli resim serisi dosyası 3D modeli yeniden inşası için confocal mikroskop ile İlişkili Yazılım alın.</li>
		<li>DAPI ve C. burnetii hemocyte ifade bir EGFP ifade mCherry ile lekeli çekirdeklerin ortak yerelleştirme gösterilen bir hücre seçin. Kırpma görüntü serisi yalnızca tek hücre içerir.</li>
		<li>Yazılımın önceden paketlenmiş algoritması kullanarak 3D modeli yeniden yapılandırır 3B görüntüleyici seçeneğini seçin. 3D temsil karışım, yüzey ve karışık seçenekleri arasında istediğiniz türü seçin. Bu yöntemde, hemocytes, çekirdek ve C. burnetii yüzey modeller kullanılarak gösterilir.</li>
		<li>Tutmak belgili tanımlık fare düğme ve belgili tanımlık perde imleci sürükleyerek 3D yeniden oluşturulan hücre çeşitli görüntüleme konumlardan gözlemlemek. Hücre yönlendirme ve görüntü optimize etmek için modellenmiş ışık kaynağının konumunu ayarlayın. Diğer seçenek saydamlık, en az ve en fazla eşik, Specular, Ambient, Shineness ve gama için görüntü optimize etmek için vardır.</li>
		<li>Kesit hemocyte iç içeriğini görselleştirmek için kırpma ve parça komutlarını kullanarak modeli üzerinden alın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. uygulama gen ve/veya protein analizi için
<ol><li>IIV6 ve Listeria, enfeksiyonla takip koşullar sonraki qRT PCR hücreleri veya Western blot analizi daha önce açıklanan21 ve aşağıdaki prosedürü yerine getirin. Not: Tablo reçetesi qRT-PCR astar ve Western blot için antikorlar için bakın.</li>
	<li>PCR ürünlerinin özel jel elektroforez tarafından güçlendirilmiş ürün uygun uzunlukta sağlamak için yukarıda açıklanan22, analiz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+of+Drosophila.">The immune response of Drosophila.</a> Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).</li><li>Regan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+signaling+is+essential+to+regulate+innate+immune+cells+and+fight+bacterial+infection+in+Drosophila.">Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).</li><li>Yano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+control+of+listeria+through+intracellular+innate+immune+recognition+in+Drosophila.">Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila.</a> Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).</li><li>Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Bacterial+Factors+Control+Susceptibility+of+Drosophila+melanogaster+to+Coxiella+burnetii+Infection.">Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection.</a> Infect Immun. 85 (7), (2017).</li><li>Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+hemocyte+load+is+associated+with+increased+resistance+against+parasitoids+in+Drosophila+suzukii,+a+relative+of+D.+melanogaster.">High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster.</a> PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).</li><li>Tsuzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+between+humoral+and+cellular+immune+responses+in+Drosophila.+is+guided+by+the+cytokine+GBP.">Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP.</a> Nat Commun. 5, 4628 (2014).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Drosophila.+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens.">Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).</li><li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+Drosophila+immunity.">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li><li>Arefin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+Hemocytes+Induces+a+Shift+in+Effector+Mechanisms+in+the+Drosophila.+Immune+System+and+Leads+to+a+Pro-Inflammatory+State.">Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State.</a> PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).</li><li>Rus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Filamin-240+in+Drosophila+blood+cells.">Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells.</a> Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemese,+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein,+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila.">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li><li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).</li><li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation.">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).</li><li>Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicing+of+viral+replication+intermediates+during+silencing+of+latent+Drosophila+viruses.">Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).</li><li>Jovel, J., Schneemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Drosophila+cells+persistently+infected+with+Flock+House+virus.">Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus.</a> Virology. 419 (1), 43-53 (2011).</li><li>Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+extracting+hemocytes+from+wild+caterpillars.">A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars.</a> J Vis Exp. (69), e4173 (2012).</li><li>Sampson, C. J., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+ex+vivo+incubation+of+Drosophila+primary+post-embryonic+haemocytes+for+real-time+analyses.">Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses.</a> Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster.">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+fruit+juice+egg+plates.">Drosophila fruit juice egg plates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).</li><li>Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+Iridescent+Virus+6,+a+DNA+Virus,+Stimulates+a+Mammalian+Innate+Immune+Response+through+RIG-I-Like+Receptors.">Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors.</a> PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva.">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li><li>Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+inverse+Poisson+distribution+to+calculate+multiplicity+of+infection+and+viral+replication+by+a+high-throughput+fluorescent+imaging+system.">Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system.</a> Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).</li><li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellocyte+differentiation+in+Drosophila.+larvae+parasitized+by+Leptopilina.">Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina.</a> Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).</li><li>Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+wounding+is+a+minimal+and+sufficient+trigger+for+a+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).</li><li>Ozgen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+invertebrate+iridovirus.">Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus.</a> Virus Res. 189, 286-292 (2014).</li><li>Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+first+complete+DNA+sequence+of+an+invertebrate+iridovirus:+coding+strategy+of+the+genome+of+Chilo+iridescent+virus.">Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus.</a> Virology. 286 (1), 182-196 (2001).</li><li>Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Coxiella+burnetii+parasitophorous+vacuole.">The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole.</a> Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+prophenoloxidases+respond+inconsistently+to+Cu2++and+have+different+activity+in+vitro.">Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro.</a> Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).</li><li>De Gregorio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immune-responsive+Serpin+regulates+the+melanization+cascade+in+Drosophila.">An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila.</a> Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).</li><li>Kari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+raspberry+Gene+Is+Involved+in+the+Regulation+of+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single-cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells.">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).</li><li>Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Binding+of+the+Conserved+Transcription+Factor+Grainy+Head+to+its+Target+Genes+Throughout+Drosophila+melanogaster+Development.">Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development.</a> Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).</li><li>Yang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomes+of+lineage-specific+Drosophila+neuroblasts+profiled+by+genetic+targeting+and+robotic+sorting.">Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting.</a> Development. 143 (3), 411-421 (2016).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Immune+Circuits+by+Linking+CRISPR-Pooled+Screens+with+Single-Cell+RNA-Seq.">Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.</a> Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).</li><li>Karaiskos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+embryo+at+single-cell+transcriptome+resolution.">The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution.</a> Science. 358 (6360), 194-199 (2017).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Nasıl konak hücreleri enfekte olma daha iyi anlamak için özellikle daha önce denenmemiş patojen ve hücre tipi kombinasyonları4' te deneme zaman patojen hücrelerdeki lokalizasyonu netleştirmek önemlidir. Enfeksiyonu takip hücresel yanıt basamaklı eğitim üretken patojen işgali gösterebilir iken, görüntüleme ve hücresel yanıt verilerini kombinasyonu patojen işgali ve enfeksiyon göstermek için önemlidir. Patojen işgalinin 2D görüntüleri ana hücreleri gösteren raporlar ...

Drosophila melanogaster doğuştan gelen bağışıklık1incelenmesi için bir iyi kurulmuş model organizmadır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı sırasında hemocytes yanıt patojeni meydan okuma olarak önemli bir rol oynamaktadır. Hemocytes mantar, viral ve bakteriyel enfeksiyon2,3sırasında fagositik eylem yoluyla patojen mücadelede önemli bir işleve sahip yanı sıra parazit Kapsüllenen için kritik öneme sahiptir.
En iyi ana bilgisayarın doğuştan gelen bağışıklık yanıtı patojenik mikrobiyal enfeksiyon anlamak için nasıl patojen konak hücreleri enfeksiyon sırasında işgal görselleştirmek önemlidir. Bu görselleştirme işgali mekanizmasının bir anlaşmaya katkıda bulunur. Patojen hücre içi yerelleştirme ayrıntılarını ve hücresel yanıt ile birlikte, bu veriler enfeksiyon ve hangi ile mikrop etkileşim hücre organelleri ana bilgisayar yanıt hakkında ipuçları sağlar. Böylece, 3D modeli yeniden görüntüleme mikroskobu tarafından sonra konak hücreleri patojenler tam yerini belirlemek yararlı olabilir. Bu çalışmada, Avusturya'nın Coxiella burnetii (C. burnetii), Q ateşi, insan ve hayvan sağlığı için ciddi bir tehdit teşkil etmektedir birincil Drosophila hemocytes Hayvansal bir hastalık hastalığının görüntülenir. Son zamanlarda, Drosophila 2 dokuz mil faz II (NMII) klon C. burnetii 4 suşu ve bu zorlanma Drosophila4' te, çoğaltmak yapabiliyor bu gösteren Biyogüvenlik düzeyi duyarlı gösterilmiştir Drosophila C. burnetii patogenezi okumaya bir model organizma kullanılır.
Önceki çalışmalarda hemocytes ana bilgisayarın doğuştan gelen bağışıklık yanıtı incelemek için kullandık. Hemocytes kullanılan morfolojik gözlemleri5,6,7, xarakteristikaları analiz2,8, fagositoz analiz2,3, qRT-PCR2 için , 9, immunoprecipitation10,11, immünfloresan analiz10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 ve immünhistokimya9,14. Drosophila S2 hücreleri de çeşitli vitro deneyler için kullanılabilir olmakla birlikte, onların davranış15,16-əbadoləşdirmək ve önceden var olan potansiyel viral enfeksiyon değiştirmek. Primer Hücre S2 hücreleri gibi bir ölümsüzleştirdi hücre kültürünü aksine kullanımı doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu çalışma için bir sistem tüm organizmanın daha temsilcisi sağlar. Ayrıca, hemocytes vivo, ayıklama önce enfeksiyonu hücrelere diğer ana bilgisayar proteinler ve doku, hemocytes ex vivo enfeksiyonu önce çıkarılması üzerinde bir avantaj etkileşim sağlar. Birkaç farklı yöntem hemocytes yeterli sayıda hemocytes canlı8,17,18,19tutmak için zaman kısa bir süre içinde elde etmek için kullanılmıştır.
Bu çalışmada, biz Drosophila 3rd INSTAR larva C. burnetii, Listeria Monositogenez (Listeria) veya omurgasız yanardöner patojenik mikrobiyal enfeksiyon için hemocytes ayıklamak için bir yöntem mevcut virüs 6 (IIV6). Vivo ve ex vivo hemocyte enfeksiyon yöntemleri açıklanmaktadır. Vivo- ve ex vivo-virüslü hemocytes confocal mikroskobu ile görüntülenir ve C. burnetii işgalinin 3D modeller oluşturmak için kullanılır. Buna ek olarak, ex vivoayıklama iletişim kuralını kullanarak-virüslü hemocytes için gen ve protein ifadesi kullanılmıştır deneyleri. Özellikle, IIV6 ve Listeriaenfeksiyonu ölçüde incelemek için toplam RNA veya protein qRT-PCR veya Western blot analizi için hücrelerden izole edildi. Birlikte ele alındığında, protokol hızla hemocytes sayısının fazlalığı 3rd INSTAR larva ve birincil hemocytes, in vivo veya ex vivoenfekte kanıt toplamak için yöntemler sağlar, için uygun bir platform olan mikrobiyal patojen enfeksiyon çalışmaları ve ilgili aşağı akım analizleri mikroskobu, transcriptomics ve proteomik gibi.

<table><tbody><tr><td>Schneider&#039;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences&amp;nbsp; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filter (0.22 &amp;micro;L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>Strainer (100 &amp;micro;m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr><tr><td>Capillary puller</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;delivery apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Coxiella burnetii&lt;/em&gt; - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; fruit juice plates</td><td>Cold Spring Harbor Protocols</td><td></td><td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>Methyl paraben</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch&#039;s 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL</td><td>Amazon</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>Petri dishes, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)</td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Holding forceps</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>Antifade mounting medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>3D imaging reconstruction software</td><td>Leica</td><td>LASX with 3D visualization module</td><td>3.3)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>strain: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 &amp;micro;g/ml streptomycin at 30 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>gDNA degradation</td></tr><tr><td>cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA synthesis</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3&#039;</td></tr><tr><td>IIV6_193R_R</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3&#039;</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_fwd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_rev</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Green qRT-PCR reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Listeria monocytogenes antibody</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Actin antibody produced in rabbit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis

Drosophila melanogaster, patojenik enfeksiyon sırasında hemocytes enfeksiyon boyunca bağışıklık yanıtındaki önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, bu iletişim kuralının amacı belirli bir bağışıklık yerde uçar, yani hemocytes patojen işgali görselleştirmek için bir yöntem geliştirmektir. Burada 3 × 10 anlatılan yöntemle6 canlı hemocytes 200 Drosophila 3rd INSTAR larva ex vivo enfeksiyon için 30 dk içinde elde edilebilir. Alternatif olarak, hemocytes enfekte vivo içinde 3rd INSTAR larva için 24 saat sonrası enfeksiyon hemocyte çıkarma tarafından takip enjeksiyon yoluyla olabilir. Bu virüslü primer hücre tespit edildi, lekeli ve confocal mikroskobu kullanarak yansıma. Sonra 3D temsilcilikleri patojen işgal kesin olarak göstermek için görüntülerden üretildi. Ayrıca, yüksek kaliteli RNA qRT-PCR patojen mRNA şu tespiti için elde edilebilir enfeksiyon ve yeterli protein hulâsa Western blot analizi için bu hücrelerden. Birlikte ele alındığında, biz patojen işgalinin kesin uzlaşma ve enfeksiyon bakteriyel ve viral patojen türleri ve verimli bir yöntem hemocyte çıkarılması için yeterli canlı hemocytes Drosophila elde etmek için kullanarak onay için bir yöntem mevcut larva ex vivo ve in vivo enfeksiyon deneyler için.

Hemocytes ex vivo enfeksiyonu, 3 × 10 toplamak yaşamak için6 hemocytes 200 Drosophila 3rd INSTAR larvaları elde. Bizim yöntem geliştirmek için bir takım farklı teknikler denendi. Bireysel larva diseksiyon en fazla 1,5 saat sürer ve ortalama ~ 8000 hücre elde edilen en çok hangi koleksiyonun sonuna tarafından canlı değildi bu yöntemi18, kullanarak. Daha sonra hemocytes bulunan hemolymph çıkarmak için çalı?...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis at JoVE.com

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

extraction-hemocytes-from-drosophila-melanogaster-larvae-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

11.6K Görüntüleme.  Washington State University. Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.

Video: Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Gelişim Biyolojisi

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Biyoloji

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Vahşi Tırtıllar gelen Hemocytes ayıklamak için basit bir protokol

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

Drosophila melanogaster Larva Enjeksiyon Protokolü

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Cuticle Disruption: A Method to Collect Hemolymph from Drosophila Larvae

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www.jove.com/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila hemolymph serves as both blood and interstitial fluid, circulating throughout the body during the larva and adult stages. This video describes a protocol to collect larval hemolymph in order to quantify the circulating cells.

Kütikül Bozulması: Drosophila Larvalarından Hemolenf Toplamak İçin Bir Yöntem

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster (meyve sineği)

Larva

Larval Lymph Gland Dissection: Isolating the Drosophila Hemocyte-Producing Organ

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www.jove.com/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the Drosophila lymph gland&#8212;the primary site of hematopoiesis in the fly larva&#8212;and shows an example protocol to dissect and mount the organ for immunohistochemistry and fluorescent imaging.

Larva Lenf Bezi Diseksiyonu: Drosophila Hemosit Üreten Organın İzole Edilmesi

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes ...

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için

Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde