Floresan korelasyon spektroskopisinin en iyi prensibi olan FCS, başlangıçta 1970'lerde icat edildi. 1990'larda konfokal aparat mikroskopisi ile birleştirilerek FCS için önemli ve birçok iyileştirme kurulmuştur. O zamandan beri FCS, moleküler etkileşimler ve protein toplama analizi gibi birçok kimyasal ve virüs kür uygulaması için kullanılmıştır.
Protein toplama nörodejeneratif bozuklukların ayırt edici bir özelliğidir. Floresan parlaklığı, difüzyon özellikleri ile açıklanan moleküler boyutlarda hareket eden tek parçacıklardır. Protein toplamalarının ölçülmesinde çok önemlidir, çünkü moleküllerin öngörülen yaşam döngülerini belirleyebilir, aynı zamanda homo veya hetero polimerizasyonunu ayırt edebilir.
Burada, hücre lysates ve canlı hücrelerde FCS kullanarak agrega formu proteini ile ilişkili amyotrofik lateral sklerozun difüzyonunu ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Normal büyüme ortamında rahatça oturarak 100 milimetre plastik tabak büyüyen Neuro2a hücresi hazırlayın. Hücre konfluensi onaylayın.
Ortamı çıkarın. Üçüncü kartuş kabına 3,5 mililitre Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve bir dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Yemeğe 9,5 mililitre normal büyüme ortamı ekleyin ve askıya alın.
Hücre süspansiyonu, ölü hücreleri lekelamak için trippan mavisi ile karıştırılır. Hücre sayma slaydına askıya alma ekleyin. Hücre sayacı veya el ile kullanarak hücre sayısını sayın.
Canlı cep telefonu numarasını ve canlılıklarını kontrol edin. Sayılan ortamdaki hücreyi mililitre başına 5 gücünde 1.0 kez 10'da seyreltin. Canlı hücre ölçümü için hücre lizisi veya büyüme alanı çanağı için 35 milimetrelik plastik kabın içine iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Yemeği bir gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün plazmid DNA ve transfeksiyon reaktiflerinin karışımını hazırlayın. Transfeksiyon karışımını hücre sayılan ortama ekleyin ve hücreleri 24 saat kuluçkaya yatırın.
Bir gün sonra. Rutin bir mikroskop kullanarak GFP ifadesini denetleyin. Hücrelerdeki çok parlak TDP25 bileşen gövdelerini görebilirsiniz.
Hücre lizisi biyokimyasal tezgahta yapılmalıdır. Tabaktaki ortamı çıkarın. Orta olarak yıkamak için 25 santigrat derecede iki mililitre PBS ekleyin.
PBS'yi çıkarın. Kabı ezilmiş buzun üstündeki alüminyum bir tabağa yerleştirin. Hemen, 200 mikroliter liziz tamponunu kabın içine ekleyin.
Bir hücre kazıyıcı kullanarak yemeği kazıyın. 1,5 milimetrelik yeni bir tüpte çözülmemiş hücre kalıntılarıyla lisatı kurtarın. Lysate'i dört santigrat derecede santrifüjle.
Canlı hücre ölçümleri için, ölçümden önce ortamı yenisiyle değiştirin. Faz kontrastı mikroskobu kullanarak hücre ekini kontrol edin. Ayrıca, floresan mikroskobu kullanarak GFP ifadesini kontrol edin.
Konfokal mikroskop kombine FCS sistemi kullanın. 488 nanometre lazeri açın. Sistemi en az 30 dakika sabitleyin.
Optik yolu kurun. Anlık ışık için 488 nanometre lazer kullanın. Uygun bir ışın ayırıcı ve dikroik sayaç kullanın.
Ve ayrıca, floresan sigortaları. Genellikle, kalibrasyon ve çözelti ölçümleri için kapak odalarını kullanacağız. Dikkatlice, kapak odasını alın.
Cam yüzeyi lens tarama kağıdına yerleştirin. FCS kalibrasyonunu dökün. Rhodamine 6G çözümünü de ekleyin.
Hedefe ultra saf suyu ekleyin. Yağı kullanmayın. Odayı mikroskop aşamasına getirin.
Sahneyi uygun konuma getirin. İğne deliği ayarını oluşturun ve iğne deliği ayarlama sihirbazını açın. Foton sayım hızını x yönü için iğne deliğinin kaba hareketi olarak izleyin.
En parlak pozisyon haklı olarak belirlendi. Ardından, foton sayım oranını ince hareket olarak izleyin. En parlak konum başarıyla belirlendi Bu x yönü için iğne deliği konumudur.
Aynı şekilde, iğne deliğinin en parlak konumunu y yönü için arayın. Y yönü için en parlak konum da başarıyla belirlendi. İğne deliğinin x ve y konumunu birleştirir.
Her günün ölçümünden önce iğne deliği konumunu ayarlamak daha iyidir. Canlı yol değiştirildiğinde, iğne deliği konumu yeniden ayarlanmalıdır. Bir sayım oranı oluşturun ve telefon sayım hızını izleyin.
BGBM izleme moduna geçin. BGBM değerinin en yüksek olması için çalıştırdığınız nesnenin düzeltme halkasını sayın. Sayım oranı penceresini kapatın.
Rhodamine 6G çözüm ölçümü ile başlayın. Ölçüm tamamlandıktan sonra, Eğri Sığdırma Analizi gerçekleştirmek için sığdır'ı tıklatın. Eski korelasyon işlevinin takılması için bir model seçin.
Rhodamine 6G için, üçüz durumda 1 bileşenli, 3 boyutlu difüzyon için modeli seçin. Kırmızı çizgiyi hareket ettirerek montaj başlangıç saatini ayarlayın. Sığdırma hesaplamasını başlatmak için Tüme Sığdır'ı tıklatın.
Uyum sapması kontrol edin. Tarafların sıfır civarında deftere nakledilip negatif olduğundan emin olun. Takılan değerleri kontrol edin.
Difüzyon süresinin kabaca 20-30 mikrosaniye aralığında olduğundan emin olun. Ayrıca, yapısal parametre dört ila sekizdir. Sığdırma panelini açın ve ölçüm için bir model seçin.
Uygun paneldeki numunenin modeline aynı yapısal parametre değerini girin. Türün Sabit olarak ayarlanacağından emin olun. Hücre lisatında GFP-TDP25 ölçümü.
Lysate'i kapak odasına yerleştirin. Lisatın kurumasını önlemek için kapağı yerleştirin. Işık gölgelendirmesi için sahne kapağını yerleştirin.
Alım panelinde lazer gücünü, ölçüm süresini ve tekrarlarını ayarlayın. Satın almaya başlayın. Bir ani artış gözlendi.
Yine bir ani artış gözlendi. Ani artış, algılama gövdesinden geçen parlak molekülleri gösterir. Sivri uçlar çözünür oligomerleri veya agregaları gösterir.
Eğri sığdırma analizi yapmak için bir uyum oluşturun. Üçüz durumdaki 2 bileşenli, 3 boyutlu difüzyon için modeli seçin. Uygun başlangıç saatini ayarlayın.
Tüme Sığdır'ı tıklatın. Takılan değerleri kontrol edin. CANLı HÜCREDE GFP ölçümü ile etiketlenmiş SOD1-G85R.
Çözelti ölçümünün aksine, ısı evresi inkübatörü kullanmanızı öneririm. Mikroskop sahnesinde hücre kültleme kabını ayarlayın. Oküler kullanarak odağı ve konumu onaylayın.
Bir ölçüm hücresi seçin. Hızlı tarama modu kullanarak hücre konumunu yakınlaştırın ve ayarlayın. Yavaş tarama hızı modunu kullanarak hücrelerin anlık görüntüsünü alın.
Konum aracını kullanarak bir FCS ölçüm pozisyonu seçin. Çapraz çizgi ölçüm pozisyonunu gösterir. Ölçüme başlayın.
Foton sayım oranı kaydının hafifçe azalması GFP'nin fotobleaching olduğunu göstermektedir. Eğri montajını gerçekleştirin. Hücre lisatında GFP-TDP25'in temsili sonuçları gösterilmiştir.
Üst grafik foton sayım oranının bir kaydı. Okların olduğu yerde çözünür oligomerler ve agregalar öneren bir çivi vardır. Orta grafik eski korelasyon işlevini temsil eder.
Gri çizgi düşük, eski korelasyon işlevini gösterir. Macenta çizgisi takılı işlevi gösterir. Noktalı çizgiler, montaj için başlangıç ve bitiş saatlerini gösterir.
Alt tabloda takılan değer gösterilir. Daha sonra, canlı bir hücrede SOD1-G85R-GFP'nin temsili sonuçları gösterilir. Üst grafik foton sayım oranımızın bir kaydını temsil eder.
Kaydedilen foton sayım oranının kademeli olarak azaldığı gözlendi ve bu da farklı ölçümler için GFP büyümesinin fotobleaching olduğunu düşündürdü. Bunun nedeni canlı hücrelerdeki yavaş difüzyon hızıdır. Orta grafik SOD1'in eski korelasyon işlevini temsil eder.
Gri çizgi düşük, eski korelasyon işlevini gösterir. Macenta çizgisi takılan işlevi gösterir. Noktalı çizgiler, montajla başlangıç ve bitiş saatlerini gösterir.
Alt tabloda takılı değerler gösterilir. Burada, hücre lisatında TDP-25 ile ilişkili her hücreden ve FCS kullanarak canlı hücrelerde SOD1'in her mutantından difüzyonu ölçmek için bu prosedürü gösteriyoruz. Hücre lisatında çözünür oligomerler ve toplama genellikle sivri uçlar veya patlamalar olarak gözlenebilir.
Öte yandan, canlı hücrelerde, muhtemelen bariz canlı yapılar dışında, bu tür sivri uçlar nadiren gözlenir. Mutant SOD1'lerin yavaşça difüze eden bir türü, bizim için içindeki SOD1 homopolimerizasyonu gibi tek parçacıklar için ortalama parlaklık ekler. Burada gösterilen prosedür basit ve değerlidir.
FCS radyasyon içermez;doğrudan uyku durumunda. Bu sadece senin ve bizim hayal gücümüz.
