İnsan primer kapak endotelyal ve interstisyel hücre izolasyonu, kalsifik aort kapak hastalığının patogenezinin altında yatan mekanizmanın anlaşılması için kritik öneme sahiptir. Kapak doğal dokudan eksize edildiğinde, hücre canlılığı düşer. Bu yüzden hücre canlılığını uzatan bir yöntem belirledik.
Ekstrakte edilen kapak dokusu örneklerini aldıktan sonra, aort kökünü çıkarın ve dokuyu steril durulama çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe batırın. Bir rocker üzerindeki bir buz kovasında 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, tüplere% 70 etanol püskürtün. Steril bir doku kültürü başlığında, dokuyu bir Petri kabına aktarın ve iki valf broşürünü tüketin.
Bir broşürü kriyojenik bir şişeye yerleştirin ve eksi 80 santigrat derece depolama için dokuyu sıvı azotta dondurun. Kalsiyum içeriği boyama için dokuyu sabitlemek için, ikinci broşürü nodülden menteşeye ikiye bölün ve her iki doku parçasını% 4 paraformaldehit içine batırılmış bir kasete yerleştirin. Ardından, tüm kurulumu rocker'a oda sıcaklığında en az iki ancak dört saatten fazla olmamak üzere yerleştirin.
Valf geçiş hücrelerini izole etmek için, broşürü buz gibi soğuk PBS içeren yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir rocker üzerine yerleştirin. Karıştırdıktan sonra, dokuyu beş ila yedi mililitre soğuk kollajenaz çözeltisi içeren 60 milimetrelik bir kaba aktarın. Hücre kültürü inkübatöründe dokuyu 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca inkübe etmeden önce, broşürün her iki tarafını da üç ila dört kez çözeltiye batırmak için forseps kullanın ve dokunun her iki dakikada bir üç ila dört kez hafifçe sallanmasıyla birlikte.
Kuluçka sonunda, iki mililitre çözeltiyi çanaktan steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Forsepsleri broşürün nodülüne yerleştirerek, çubuğu broşür boyunca döndürürken dokuyu forsepsten menteşeye kaydırmak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. Kaydırdıktan sonra, çubuğu kollajenaz çözeltisi tüpünde durulayın ve az önce gösterildiği gibi dokunun diğer tarafını sürün.
Duruladıktan sonra, çubuğu dokunun her iki tarafında tekrarlayın ve broşür yüzeyinin her iki tarafındaki yerinden çıkmış hücreleri tabağa durulamak için bir mililitrelik pipet ve kollajenaz çözeltisi kullanın. Duruladıktan sonra, tüm çözeltiyi çanaktan çubuktan hücreleri içeren tüpe aktarın ve kalan valf dokusunu yedi mililitre steril kollajenaz çözeltisi içeren yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin. İzole edilen kapak endotel hücrelerini santrifüjleme ile pelet ve hücre peletini üç mililitre vasküler endotel hücre büyüme ortamında yeniden askıya alın.
İkinci bir santrifüjlemeden sonra, hücreleri saymak için bir mililitre taze büyüme ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri kollajen kaplı altı kuyucuklu plakalarda santimetre kare konsantrasyon başına 5 x 10 ila beşinci hücrelerde tohumlayın ve ortamı her üç ila dört günde bir yenileyin. Valf endotel hücre yamaları plakanın% 80'inden fazlasını kapladığında, hücreleri büyüme hızlarına bağlı olarak santimetre kare konsantrasyon başına 1.3 x 10'da dördüncü hücrelere bölün. Hücreler genişledikten sonra, kapak endotel hücre fenotipini, ilgilenilen kapak endotel hücre belirteçleri için immünofloresan boyama ile onaylayın.
Valf interstisyel hücrelerini izole etmek için, çubukla yaprakçık dokusunu içeren tüpü, kapak hafifçe açıkken 12 ila 18 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, valf geçiş hücrelerinin serbest bırakılmasını sağlamak için dokuyu nazikçe ayırmak için serolojik bir pipet kullanın ve hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik bir konik tüpe filtreleyin. Tüpe yedi mililitre valf interstisyel hücre ortamı ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.
Pelet, saymak için bir mililitre taze valf interstisyel hücre büyüme ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri 60 milimetre çapında doku kültürü ile muamele edilmiş bir tabakta santimetre kare konsantrasyon başına dördüncü hücrelerin 1.3 x 10'unda tohumlayın. Bir ila iki gün sonra, kültürleri PBS ile iki kez yıkayın ve hücrelere taze ortam ekleyin. Hücreler% 90'lık bir akıcılığa ulaştığında, kültürleri DPBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 37 santigrat derecede iki ila üç dakika boyunca iki ila üç mililitre önceden ısıtılmış ayrışma reaktifi ile tedavi edin.
Hücreler ayrıldığında, hücre süspansiyonunu santrifüjleme için konik bir tüpe aktarın ve peleti saymak için üç ila dört mililitre önceden ısıtılmış valf interstisyel hücre büyüme ortamında yavaşça yeniden askıya alın. Daha sonra hücreleri orijinal kültür yoğunluğuna bir ila iki oranında tohumlayın ve gösterildiği gibi immünofloresan boyama ile valf interstisyel hücre büyüme fenotipini değerlendirin. Kalsifik aort kapak hastalığı doku örnekleri, kalsifiye olmayan doku örneklerinin kontrolüne kıyasla ağır kalsifikasyon nodülleri ile değişmiş bir morfoloji sergiler.
Kalsifikasyon Von Kossa boyama ile değerlendirildiğinde, hastalıklı broşür dokusunda koyu kahverengi veya siyah çökelme görülür. Soğuk hava deposu çözeltisi, eksize edilmiş kapak dokusu hücrelerini, kapak ekstraksiyonundan 61 saat sonrasına kadar her iki geri kazanılmış hücre tipi için gözlenen yaklaşık% 40'lık bir canlılık ile büyük ölçüde stabilize eder. Kapak endotel hücrelerinin morfolojik analizi, paketlenmiş parke taşı benzeri büyüme teması inhibe edilmiş hücreleri ortaya çıkarırken, kapak interstisyel hücreleri, miyofibroblastlar için gözlemlenene benzer bir iğ şeklinde morfoloji göstermektedir.
İmmün boyama, genişlemiş kapak endotel ve kapak interstisyel hücrelerinin çoğunluğunun beklenen dokuya özgü belirteçleri ifade ettiğini doğrulamaktadır. Broşürün nazik ama sağlam bir şekilde süründürülmesinin, endotel hücre tabakasının salınması için kritik öneme sahip olduğunu ve interstisyel hücre popülasyonunun yoğun doku içinden serbest bırakılması için kollajenaz ile gece boyunca inkübasyonun gerekli olduğunu unutmayın. Hücre hatları oluşturulduktan sonra, hastalığın başlangıcı, progresyonu ve tedavisi de dahil olmak üzere spesifik aort kapak hastalığı patogenezi ile ilgili mekanik çalışma için kullanılabilirler.
