Bu protokol, biyomoleküllerin fare CNS'ye intranazal olarak ulaştırılması için bir konumlandırma cihazının kullanımını ayrıntılarıyla anlatır. Bu cihazın kullanımı farelerin kullanımı ve tedavi süresini önemli ölçüde azaltır ve tekniğin verimliliği ve tekrarlanabilirliği ile sonuçlanır. Bu prosedüre başlamak için, cerrahi düzlemi korumak için pedal refleksi ile farelerin anestezi düzeyini değerlendirin.
Ardından, gerekli tüm reaktiflere kolay erişim sağlamak için konumlandırma cihazını uygun bir mesafe ye ve yüksekliğe yerleştirin. Sonra, hayvanın gözlerine merhem uygulayın. Herhangi bir rahatsızlık olmadan rahat bir konumda iken farenin forelimbs doğal destek sağlamak emin olun, sandalye kemerleri ile bir fare kayış.
Kalan fareler için prosedürleri tekrarlayın. Her fareyi, koltuğun arka desteğine paralel olarak ve 90 derecede sandalye koltuğuna doğru uzanarak, belirlenen sandalyeye yavaşça yerleştirin. Hayvan ın baş aşağı ve ileri pozisyonda itmeden veya bastırmadan doğal olarak yatmasına izin verin.
Tüm fareler bağlandıktan sonra, hemen intranazal aşılamaya başlayın. İntranazal teslimatı gerçekleştirmek için mikropipeti iki mikrolitre RVG9R siRNA kompleks çözeltisi ile yükleyin. SiRNA'yı uygularken kontrolsüz hareketlerden kaçınmak için pipeti baskın elde tutun ve diğer elinizle destekleyin.
Faredoğrudan teneffüs böylece bir burun deliğine çok yakın iki mikrolitrelik bir damlacık hakkında yerleştirin. Küçük bir damla kolayca oluşturulmazsa, pipet ucunu yenisiyle değiştirin ve işlemi tekrarlayın. Fareyi işaret parmağıyla yavaşça aşağı doğru beş saniye itin.
İlacın akciğerlere drenajını önlemek için fare nefes alırken farenin işaret parmağıyla beş saniye boyunca sakince aşağı itilmesi önemlidir. Bundan 3-4 dakika sonra ilk farenin ikinci naresine zaman aşılanması için bir kronometre başlatın. Bu zaman aralığı fare nin ilk dozun teneffüsini tamamlaması ve normal solunumu geri getirmesi için gereklidir.
İlk farede alternatif narelerin aşılanması arasındaki üç ila dört dakikalık aralıkta, cihaza yerleştirilen kalan üç farenin her birinde bir narenin intranazal aşısını tamamlayın. Kronometre çaldığında, ilk farenin üzerindeki ikinci burun deliğini aşılamak ve yukarıdaki gibi diğer fareler için prosedürü tekrarlayın. Dört fare için 20-30 mikrolitre teslim edilene kadar işlemi tekrarlayın.
Tüm aşılama işleminin tamamlanması yaklaşık 30 ila 45 dakika sürer. Hayvanları belirlenen kafeslere geri getirin. Onlar sternal recumbency korumak için yeterli bilinç kazanmış kadar fareler gözetimsiz bırakmayın.
Gen susturma değerlendirmek için, rna arıtma kiti ile çeşitli beyin bölgelerinden RNA ayıklamak, cDNA sentez kiti kullanarak cDNA içine transkripsiyon ters, ve astar çiftleri ile qPCR gerçekleştirmek. Alexa Fluor 488 etiketli RVG9R peptid in en beyin teslim ilk burada açıklanan fare konumlandırma cihazı kullanılarak test edildi. Aşıdan sonra 48 saat sonra, Çeşitli organlar A488 floresan ölçmek için çıkarıldı.
Negatif kontrollerde hiçbir organda tespit edilmedi. Öte yandan, güçlü bir floresan A488 sinyali sadece RVG9R inostarlı grubun beyinlerinde tespit edildi. Buna ek olarak, fare yerleştirme pozisyonu supine pozisyon yöntemi ve etkinlik için uyanık yöntemi ile karşılaştırıldı.
Sonuçlar, farelerin baş aşağı ve ileri konumlandırma beyin dokusu boyunca RVG9R A488 penetrans ve birikimi ni iyileştirdiğini göstermiştir. Beyne siRNA teslimini doğrulamak için, Cy5 etiketli siRNA'ya göre karmaşık rvg9R'nin tek bir intranazal uygulamasından sonra tam beyin taraması yapıldı. PBS veya RVM9R aksine, RVG9R ile karmaşıkkoku ampul de dahil olmak üzere büyük beyin bölgelerinde siRNA güçlü bir birikimi ile sonuçlandı, korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, orta beyin, ve beyincik.
Konumlandırma cihazı fare CNS ilaç veya moleküllerin teslimi için kullanılabilir. Uygulamalar terapötik test yanı sıra CNS hücresel mekanizmaların incelenmesi için uzanır. Bu konumlandırma cihazı Batı Nil Virüsü hastalığı tedavisinde siRNA'ların gücünü göstermek için araştırmacılar tarafından kullanılmıştır, yanı sıra diğer CNS hastalıkları için tedaviler keşfetmek.
