Protokolümüz yaygın olarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimlerin yüksek iş ve hızlı tarama için kullanılabilir. Düşük maliyet ve konak metabolizmasından girişim etkileri kaçınma. Bu işlem tanıda kullanılma potansiyeline sahiptir.
İlk olarak, BIF EPS çözün ve litre başına sekiz gram konsantrasyon yapmak için bir manyetik karıştırıcı üzerinde sıcak suda ayrı ayrı nişasta. Hazırlanan temel kültür ortamı, VI, kültür VI BIF çözüm yapmak için BIF EPS çözüm 100 mililitre ekleyin. Kültür VI nişasta çözüm yapmak için nişasta çözeltisi 100 mililitre ekleyin.
Otoklav karbon kaynağı ile iki medya, ve bir kontrol olarak karbon kaynağı olmadan orta, 121 derece santigrat dakika için. Onları oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve haymen ve sistein ekleyin. Her ortamdan beş mililitrelik bir alt numuneyi kültür tüplerine aktarın.
Ve anaerobik bir kuluçka makinesinde saklayın. Kalan ortamı dört santigrat derecede saklayın. İnsan dışkı örneği hazırlamak için, bir cam kabın pH yedi 0.1 molar anaerobik PBS 10 mililitre içine taze dışkı örnek bir gram aktarın.
Sonra bir bulamaç elde etmek için karıştırmak için bir cam çubuk kullanın. Bir anaerobik odada, üç hazırlanan fermantasyon medya içine filtrelenmiş dışkı bulamaç 500 mikrolitre ekleyin, ayrı ayrı. Sonra, 37 derecede kuluçkaya yat.
24 saat ve 48 saat sonra, anaerobik odada fermente örnekleri iki mililitre toplamak. Ve sonra odanın dışında 6000 kez G'de üç dakika santrifüj. Süpernatanları polisakkarit yıkım analizi ve kısa zincirli yağ asidi ölçümleri için kullanılacak yeni santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın.
Santrifüj peletlerini 80 derecede saklayın. Her önceden kaplanmış silika jel 60 TLC alüminyum plaka üzerine fermente supernatants 0,2 mikrolitre yükleyin ve yayMak için girdap. Sonra kuruması için sıcak hava ile bir saç kurutma makinesi kullanın.
Örneklenmiş plakaların bir ucunu 20 mililitre formik asit:n-butanol:su çözeltisine, elektroforez neredeyse diğer uca kadar uzatAna kadar birkaç dakika batırın. Sonra ponpile plakaları çıkarmak ve bir saç kurutma makinesi ile kuru. Sonra boyamak için iki dakika orsinol reaktif plakaları ıslatın.
Ve tekrar kuru. Üç dakika ısıtmak için 120 santigrat derece bir fırına plakaları aktarın. Daha sonra TLC bantlarını ölçerek EPS'nin bozulmasını değerlendirmek için plakanın fotoğraflarını çekin.
EPS'nin SCFA üretimi üzerindeki etkilerini incelemek için, iki mililitrelik santrifüj tüplere bir mililitre fermente süpernatant ekleyin ve her numuneye metafosforik asitin yüzde 25 ağırlık/hacim yüzdesi 0,2 mililitre ekleyin. Girdap iyice çözümleri karıştırmak için. Karışımları 13,000 kez G'de 20 dakika santrifüj edin.
Bu arada, tüplerde 120 milimolar asetik, propiyonik, bütirik, izobütirik, valerik ve izovalerik asitlerin çözeltilerini hazırlayın. Daha sonra her bir hazırlanan asit bir mililitre ekleyin 1.2 mililitre içeren 25 ağırlık / hacim yüzde metafosforik asit. Ve standart kokteyller olarak gaz kromatografi aletiörnek şişe içine yükleyin.
Tüpleri santrifüjden çıkarve süpernatantları taze tüplere aktarın. Gaz kromatografisi analizi için süpernatantları yeni tüplere filtrelemek için 0,22 mikron filtre ile donatılmış bir şırınga kullanın. Bu çalışmada, pyg plakalarında bifidobacterium longum kültürlerinde 72 saat anaerobik kuluçka sonrası mukoid EPS üretimi gözlendi.
Kültür kazımalarının santrifüjünün, ardından etanol çökemi ve kurutulması, selüloz benzeri EPS'lerin toplanmasıyla sonuçlandı. TLC analizi, insan dışkı mikrobiyotası tarafından nişasta nın bozulma oranının BIF EPS'den daha hızlı olduğunu ortaya koymuştur. Ana Koordinat Analizi kültür VI BIF gösterir, ve kültür VI nişasta grupları, birbirinden ayrı kümelenmiş, EPS ve nişasta durumu farklı insan dışkı bakteri toplulukları şekil gösteren.
Etki boyutu üzerine Lineer Ayırıcı Analiz, collinsella, coprococcus, parabacteroides ve rhodopseudomonas cinsinin vi nişasta örneklerine göre kültür VI BIF örneklerinde anlamlı olarak daha bol olduğunu göstermektedir. Ayrıca, GC ölçümleri fermantasyon kültürlerinden ölçülen SCFA'ları asetik, propiyonik, izobütirik, bütirik, izovalerik ve valerik asitleri göstermektedir. 24 saat 48 saat fermantasyondan sonra, altı SCFA konsantrasyonundan beşi benzerdi ve kültür VI BIF, kültür VI nişastası ve kültür VI grupları arasında istatistiksel olarak farklı değildi.
Ancak, proprionik asit konsantrasyonları kültür VI BIF grubunda kültür VI nişasta grubuna göre anlamlı olarak daha yüksekti, fermantasyon 48 saat sonra. Anaerobik koşullar altında bu deneyi yapın ve sonra en kısa sürede bir anaerobik kuluçka içine sabit örnekleri aktarın. Bazı TLC reaktifleri tehlikelidir.
Onları kullanırken dikkatli olmalısın.
