Bu çalışma n 602.699 (DIREKT) ° hibe sözleşmesi kapsamında İsveç Araştırma Konseyi (90.293.501, A0290401, A0290402), Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı hibe tarafından desteklenen, Novo Nordisk Vakfı, Gurli ve Edward Brunnberg Vakfı, Tedavi, Vleugel Kök Vakıf ve Åke Wiberg Vakfı.

NOT: Kan Uppsala Etik Değerlendirme Kurulu (Izin sayılı 2008/264) ile onayı açık sistem Venipunktür sağlıklı bireylerden çizildi. 1. Tohum Hücreler <ol><li> T75 şişeleri içinde% 5 37 ° C&#39;de CO2 ile kültür primer insan göbek damar endotelial hücreleri (HUVEC), PBS pH 7.4 içinde% 1 jelatin ile kaplanan. </li><li> T75 HUVEC ihtiva eden bir şişeye (ya da primer insan endotelyal hücreleri bir türden) kültür ortamı çıkarın ve PBS pH 7.4 içinde 2.1 mM EDTA ile hücrelerin yıkayın. 37 ° C, 3 dakika - 1 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyerek ve 2 inkübe edilerek hücreleri ayırın. </li><li> PBS pH 7.4 içinde 9 ml% 10 FBS ile balon durulanarak hücrelerini toplamak ve 15 ml&#39;lik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın. 5 dakika boyunca 735 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> Süpernatantı ve endotel hücre büyüme ortamı mikrovasküler (AT GMMV) dikkatli bir hücre pelletini tekrar süspansiyon ve bir Bürker bölmesi içinde hücreleri sayın. 21,000 c Seedarşın / 1-kuyulu hücre kültürü slaytlar cm2 ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kültür - 2 gün HUVEC sonra 1 birleştirilebilmeli olacaktır. Bir ışık mikroskobu altında hücre morfolojisi ve kaynaşma gazetesine izleyin. </li></ol> Tüm Kan 2. Hazırlık <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak hareketsizleştirilen heparin (CHS) içindeki bir çift tabaka ile kan ile temas halinde olan tüm yapay yüzeylerin hazırlayın. Tozdan, CHS Kaplanmış malzemeler fonksiyon kaybı olmaksızın 6 aya kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Kan endotel odası deneye başlamadan önce kısa bir süre sağlıklı bir donörden (&lt;30 dakika) kan çekmek için açık sistem Damara kullanın. Dikkatli bir CHS kaplı 50 ml tüp kan toplama önce: (2 mm iç çap) çift bir derialtı iğne CHS kaplamalı silikon tüp için (18 G 50 mm x). Fraksiyonlanmamış heparin ile Ek kan 0.75 IU / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere. Inve yavaşça kan karıştırın- 3 kez tüpü 2 rting. </li></ol> 3. Kan Endotel Odası Modeli <ol><li> PMMA slayt (25 x 75 mm) &#39;ye yapıştırılmıştır iki silindir (yükseklik 8 mm çapı 9 mm)&#39; den oluşan akrilik polimetil metakrilat (PMMA) &#39;de, kan bölmeyi (üstten bakış Şekil 1A) imal. Kültürlü endotel hücreleri (Şekil 1B) ile cam slaytlar karşı kan odası mühür kauçuk O-halkaları ile yukarı bakacak silindir kenarlarına uyacak. Daha sonra dikey bir pozisyonda (Şekil 1C), endotel hücreleri ile kültür sürgüye bağlı olan, kan odaları döndürün. </li><li> Kan etkinleştirmek için değil kamara alarak dikkat kaplı her CHS içine 1.5 ml kan aktarmak için bir CHS kaplı pipet kullanın. </li><li> MK ul 0,34 3 EDTA 30 ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüplerine transfer 1 ml kan kullanılarak yapılan ilk plazma protein konsantrasyonlarının belirlenmesi için, 10 mM K 3 EDTA bir son konsantrasyon elde etmek üzerebir enzim immün testi (ELISA). Dikkatle kan karıştırın ve buz üzerinde tüpler tutmak. </li><li> PBS pH 7.4 içinde Hücreleri yıkamak dikkatli bir şekilde, üretici talimatlarına uygun olarak hücre kültürü cam slaytların plastik duvarlar çıkarın ve. Sonradan slaytlar mümkün olduğunca çok sıvı çıkarmak için emin olun. Hücreler kurumasına izin vermeyin. </li><li> Kan bakan hücreleri ile kan bölmelerin üzerine slayt yerleştirin. Kan endotel hücre odasının etrafında bir kelepçe koyarak slayt sabitleyin. Kelepçenin yerleştirirken hücre kültürü cam slayt kırılmasını önlemek için ek destek için plastik bir slayt kullanın. </li><li> Bir 37 ° C su banyosu içinde dönen bir tekerlek üzerinde, kan endotel hücre bölme saptamak (40 cm çapında), bir yer. 30 dakika boyunca 0.5 xg&#39;de tekerleğin her odasına döndürün. </li><li> İnkübasyondan sonra, kan endotel hücre bölme ortadan kaldırmak. F PBS pH 7.4 &#39;da hücre kültürü slaytlar yıkayıp (PFA), buz gibi soğuk% 1 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit edilmeleriya da 10 dakika. | Il 0.34 MK 3 EDTA 30 ihtiva mikrosantrifüj tüplerine her bölmeden transfer 1 ml kan, 10 mM K 3 EDTA bir nihai konsantrasyona ulaşmak ve Tüpleri yavaşça karıştırın. Buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 4560 x g&#39;de tüpler santrifüjleyin. Daha fazla analiz edilinceye kadar -70 ° C&#39;de yeni bir mikrosantrifüj tüpleri ve saklamak için kan plazması aktarın. </li></ol> Kan Endotel Etkileşimleri 4. Analizi <ol><li> İkinci keçi anti-fare Alexa 488 ve falloidin-TexasRed ardından fare anti-insan CD16 ile immünofloresan boyama yapın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, her boyama adımı gerçekleştirmek ve her adım arasında PBS pH 7.4 slaytlar yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAPI ile çekirdek Counterstain. Görüntü analizi gibi CellProfiler gibi uygun resim analiz yazılımı kullanılarak kombinasyon halinde floresan mikroskobu altında endotel hücrelerine bağlı kan bileşiklerinin analiz edin. </li><li> QuantiFY plazma numunelerinin üreticinin talimatlarına göre trombin antitrombin (TAT) ELISA ile, kan bölmesine reaksiyonları. </li><li> Uygun istatistiksel araçlar, örneğin kullanın., Eşleşmemiş bir t testi, verileri analiz etmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Kan ve damar duvarı arasında çok sayıda etkileşim nedeniyle normalde endotelyumun yapıştırıcı olmayan ve anti-trombotik yapılı bir hareketsiz bir halde muhafaza edilmektedir. 7 iltihabı kapsayan patolojik durumlar esnasında, endotel yapışma reseptör ifadesi 8&#39;de ortaya çıkan bir artış ile aktive edilir ve Bir yeteneği azalır inhibe hemostaz. sırayla kan kaskad sistemlerin 9 aktivasyonu daha tromboz ve lökosit neden endotel trombojenisiteyi güçlendirir. 10 endotelyal hücreler ve tam kandan arasındaki bu hassas etkileşimleri daha iyi bir anlayış kazanmak için, biz var kültürlenmiş endotel hücreleri, tam kan ile temas içinde yerleştirilir bir in vitro yöntem roman geliştirdi. Bildiğimiz kadarıyla, bizim kurulum daha uzun süreler için hiçbir ile tam insan kanı ya da çok az antikoagülan ile kuluçkaya endotel hücreleri göstermek için ilk. nt &quot;&gt; Bu sistemin duyarlılığı kan ile temas halinde yerleştirilen tüm yüzeyler üzerinde immobilize heparin koruyucu bir tabaka ile kombinasyon halinde açık sistem delme ile etkinleştirilir., kan tedarik esnasında açık bir sistem kullanılması damar delinerek sırasında kademeli sistemlerinin aktivasyonu azaltır pıhtılaşma önleyici bir kendi kendine belirlenmiş bir miktarının kullanımına olanak iken. Ticari olarak temin edilebilen boşaltılmış kan tüplerinden Bununla birlikte, araştırmanın amaçlanan nihai noktalara bağlı olarak kullanılabilmektedir. piyasada bulunan kapalı bir sistem tüplere ilave antikoagülan nihai konsantrasyon duyarlı önleyebilir ve aksi sabit kurulumunda, etkileşimini incelemek. 6 koruyucu heparin yüzeyi, bundan başka, endotel hücreleri dışında herhangi bir yüzey ile yüzey teması kanın aktivasyonunu ortadan kaldırır. 5 Gerçekten de, fraksiyonlanmamış heparin, az miktarda ilave edilmiş tüm kanın inkübasyona CHS koruma olmadan oda pıhtı oluşmasına neden oldu. <pSınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; hazne içerisindeki hava kabarcığı endotel hücreleri ile inkübasyon sırasında kan karıştırılmasını sağlar. Hava baloncuk büyüklüğünün etkisini değerlendirmek için, iki farklı kan hacmine kullanılır. Bu modelde, HUVEC ile inkübe odalarına bağımsız olarak hava kabarcığı boyutu içindeki TAT seviyeleri ölçüldü. TAT, ancak tam CHS daha küçük bir hava kabarcığı boyutu ile artan odaları muamele edilmiş oldu. Bu, daha önce tarif endotel hücre özellikleri 11 uygun olarak, atıl CHS bölmesi içinde eksik olan endotel hücreleri tarafından sağlanan pıhtılaşmasının artması aktivasyonu üzerine düzenleyici bir etkisi gösterir. Sistemde hava kabarcığı bölmenin dönüş hareketi üzerine bir hava akımı yaratır. Balonun büyüklüğü bu dönen sistem içinde güçleri etkileyecektir. Bu küçük bir kabarcık, kan yani üzerine bir azalma kuvveti temsil eden yüksek TAT değerleri oluşturur Şekil 2B bizim sonuçlarla vardı gösterilir, kan hareketihaznesinin alt ve kaskadlı sistemin böylelikle aktivasyonu daha yüksek bir düzeye kadar ayrılması cereyan içinde. Bu sistemde, bizler, duvarlar ve merkezi düşük boyunca en yüksek hız ile bölmesi üzerinde hız farklı olacak bir döner akış oluşturma olduğu belirtilmelidir. Bu tabii ki endotel hücreleri için akış açısından ve makaslama kuvvetleri ile optimal bir ortam değil, ama yine de biz istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar üreten bir sistem var. Diğer uygun koşullar türbülans olmadığında laminer akış sirkülasyon içerir. Bu, burada gösterilen modelde, ancak, mümkün değildir, bizim bilgimize göre, böyle bir sistem Şu an için mevcut değildir. , Sisteme eklenen antikoagülan için hiç veya düşük seviyeleri ile tam kan ile birleştirmek mümkün olmayan çok sayıda mikro-akışkan sistemleri piyasada mevcut olmasına rağmen bu şekilde, kan ve endotelyal hücrelerde bulunan tüm bileşenler arasındaki etkileşimlerin uygun hassas değerlendirilmesine olanak başarısız. Ayrıca, TNFa, bağımsız bir kan hacminin TAT&#39;ın bir kat oluşumu ile birlikte, HUVEC aktive yönelik kan hücrelerinin işe bir 2-kat daha yüksek olmuştur. Bu model sisteminin stabilitesini doğrular ve ayrıca, bütün kandan ile kombinasyon halinde bir aktive endoteli kullanma olasılığını göstermektedir. Kan endotel hücre bölmesi çeşitli koşullar ve aktivasyon safhaları altında hücreleri üzerinde ifade edilen markerler arasında çeşitli aktive edilmiş endotel hücrelerine karşı daha fazla kan hücre alımını incelemek için kullanılabilir Gelecekteki. Model ayrıca iltihaplı durumların üzerindeki etkileri değerlendirmek için yapılan farmakolojik maddeler ile kombinasyon halinde kullanılabilmektedir. Özetle, biz vasküler hastalık ilgili araştırmalar yapmaya vitro sistemde tam bir beşer yaratacağım insan kanı ve damar hücreleri ile bir odası modeli birleştirerek büyük fayda göstermektedir.

Kardiyovasküler hastalık kan-damar etkileşimlerini analiz yöntemleri genel hayvan araştırma deneyleri içeren. Deneysel araştırmalar hayvan modellerinde oluşturulur Bununla birlikte, sonuçlar. Insan hastalıkları için çok az veya hiç bir etkisi vardır, 1,2 olabilir, kan bölmesi ve vasküler endotel hücrelerinde arasındaki hücresel etkileşimlerini incelemek üzere in vitro modellerde iyi ve güvenli bir ihtiyaç vardır Bir insan gibi sistem. Bu nedenle bir kan endotel hücre odası modelini kurduk. Bu biyomalzeme ve insan bütün kan arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılan daha önce tarif edilen modeline dayanır., Genellikle saflaştırılmış bileşenler, sınırlı sayıda diğer in vitro kurulumları 3 aksine örneğin, trombositler, lökositler ya da endotel hücrelerinde mevcuttur, bu model, tüm kapsar Bileşenler, bir kan damarı içinde mevcut. Kan endotel c kurulumuell odası modeli çok az veya hiç katma antikoagülan ile taze çekilmiş insan kanının kullanımını sağlamak için tasarlanmıştır. Uzun süreler boyunca depolanan kan yüzden eritrositlerin parçalanması kan ve endotel hücreleri arasındaki hassas etkileşim engel olabilir depolama lezyonlar olarak adlandırılan edinirler. 4 Ex vivo olarak bütün kanın kullanımı sırasında, pıhtı oluşumunu önlemek için antikoagülan veya kan ile temas halinde olan tüm madde olmayan aktive olması yüksek dozlar istenmektedir. Olmayan yüzey aktivasyonu laboratuar ortamında nadir olduğu için, malzeme seçenek olarak hareketsiz heparin bir koruyucu tabaka ile donatılmış olabilir. Hareketsizleştirilmiş heparin Koruyucu bir kat, kan iletişim Pıhtılaşma şelalesinin aktivasyonu neden olmaksızın ortaya çıkan bir yüzey oluşturarak çok malzeme tatbik edilebilir (buradan sonra Corline heparin yüzey (CHS) olarak anılacaktır). 5 Bu durumda, olan kabinleri mobilya tarafından CHS, kan endotel ceII haznesi modeli kan antikoagulan çok düşük konsantrasyonlarda kullanılmasını sağlar. Kan endotel odası modelinde antikoagülan yüksek konsantrasyonlarda ilave kaçınmak aksi maskelenebilir olabilecek bir kan damarının içindeki hassas etkileşimler üzerinde çalışmak mümkün kılar. 6 Plastik mikroskop lamı:;: (9 mm yarıçapı 8 mm yüksekliği) kan endotel hücre odası modeli plastik silindirler bağlanmasıyla oluşturulan iki odadan oluşmaktadır. Silindirlerin üzerinde yukarı bakacak şekilde kenarları hücre kültürü lâm odacıkları kapatılması için kullanılan lastik O-halkası ile donatılmıştır oluklar ile donatılmıştır. Bölmeler, yalnızca kısmen bölmeler daha sonra dik bir konumda (Şekil 1) döndürüldüğü zaman bölme içinde kalan bir hava hareketinin içine kan tutar olarak kan ile doldurulur. Modelin işlevselliğini değerlendirebilmek için, biz ya da tamamen CHS, kaplanmış olan deneyler yaptıkodası veya İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC). İki ayrı kan hacmi deneye tabi tutuldu ve trombin antitrombin (TAT) komplekslerinin (pıhtılaşmasının dolaylı bir göstergesi) oluşumu enzim bağlantılı immunosorbent tahlil (ELISA) ile ölçüldü. Daha sonra kan miktarı ve tümör nekroz faktörü (TNFa), resim analizi ile lökosit göçünün endotel hücrelerini stimüle etkisini değerlendirmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Kan endotel hücre odası modeli 1. Setup Şekil. (A), en iyi PMMA yapılan kan odasının şematik bir çizimi görüntülemek. (B): Primer insan endotel hücreleri, 1-çukurlu oda slaytlar üzerinde kültürlenmiştir. Taze, insan bütün kan, bir mikroskop lamı üzerine iki bölme eklenir. Kan işlemek için kullanılan odaları ve tüm malzeme koruyucu HS kaplama ile tedavi edilir. Ce duvarlarını çıkardıktan sonrall kültür slayt, hücreler kana karşı karşıya yerleştirilir ve sistemin kapalı kenetlenir. (C) Kan endotel hücre bölmeler daha sonra 37 ° C olarak dönme altında inkübe edilir. Daha sonra, kan bölmesine reaksiyonlar ELISA ile analiz edilebilir ve endotel hücreleri mikroskopi ile analiz edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

Tüm bilinen hastalıkların çoğunluğu kalp-damar sistemi bozukluklarının eşlik eder. Kalp-damar hastalıklarının sırasında aktif etkileşim yollarının karmaşıklığı çalışmalar, sağlam ve fizyolojik olarak ilgili yöntemler eksikliği ile sınırlıdır. Patolojik vasküler olayları modellemek için biz endotel ve bütün kan arasındaki etkileşimi incelemek için in vitro bir analiz geliştirdik. Tahlil, insan tüm kan ile temas halinde yerleştirilir primer insan endotel hücreleri oluşur. Yöntem, bir kan damarı içinde mevcut moleküler ve hücresel bileşenleri arasındaki hassas etkileşimlerin çalışma sağlayan, hiç veya çok az pıhtılaşma önleyici ile natif kan kullanmaktadır. Biz ile ya da insan göbek bağı damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) olmadan inkübe farklı kan hacmine göre pıhtılaşma aktivasyonu karşılaştırarak tahlilin özelliğe incelenmiştir. Daha büyük bir kan hacmi katkıda Oysatrombin antitrombin oluşumunda bir artış (TAT) kompleksleri, HUVEC varlığı koagülasyon indirgenmiş aktivasyonunu göstermiştir. HUVEC tümör nekroz faktörü (TNFa) ile uyarıldı ve kan temas sonrası, uyarılmamış hücrelere kıyasla, TNFa uyarılmış hücrelerde anlamlı olarak yüksek olduğu CD16 + hücrelerinin varlığı kurmak için Bundan başka, lökosit eklenme görüntü analizi uygulandı. Sonuç olarak, bu analiz, endotel ve kan bölmesi arasında etkileşimler altüst vasküler patolojiler, çalışma için tatbik edilebilir.

CHS Kaplama Gerekliliği Endotel hücreleri tarafından ortaya kişilerce belirli tam kanda tepkisini ölçmek için, kan endotel hücre bölmesi için kullanılan bütün malzeme kullanım öncesi CHS, bir kaplama ile temin edilmelidir. Şekil 2A, (sol) ve 30 dakika sonra, kaplanmamış odasını göstermektedir açıkça görülebilen bir pıhtı varken kan teması. Öte yandan, CHS ile bölmesi (Şekil 2A, sağ) tedavi edilmesi sonuçları, endotel hücre kan etkileşimler nedeniyle sağlanması, kontrolsüz aktivasyonu kan korur. Odasına Kan Hacminin Etkisi Aktive edilmiş koagülasyon faktörleri arasındaki etkileşim olasılığı artar gibi pıhtılaşma aktivasyonu durgun kan daha büyük ihtimal olması. Kan endotel hücre bölmesi modelinde kan bağlı bölmesi içinde hava kabarcığı dolaşımına hareket tutulur. O daSarf nedenle de hava kabarcığı boyutunu kan hacmindeki değişikliklerin etkisini belirlemek, ve, bir CHS kaplı odası, 1.5 ml veya 30 dakika boyunca 1.75 ml tam kan ile test edildi bir CHS kaplı cam slayt bağlandı. Kan 1.75 ml kan 1.5 mi (Şekil 2B) kullanılması durumuna kıyasla bölmeye eklendiğinde bir hava kabarcığı herhangi bir hareketi olmaksızın kan hacmi 2.5 kat daha büyüktür. Ölçülen TAT değerleri artmış kan hacmi (Şekil 2D) ile TAT-oluşumunu arttırmıştır önerdi. HUVEC (Şekil 2C), bütün haldeki kan, 1.5 veya 1.75 ya ml ile inkübe edildiğinde, herhangi bir fark endotel hücreleri, pıhtılaşmanın aktivasyon (Şekil 2D) etkili olabileceğini düşündürmektedir, iki grup arasında not edilmiştir. Kan Hücresi Elemanların TNFa&#39;nin Etkisi ve pıhtılaşma aktivasyonu Lökosit istihdamına TNFa etkisini incelemek amacıyla, HUVEC tedavi edildi20 ng ed / ml TNFa 4 saat kan teması önce. Kan temas - ya 1.5 ml ya da 1.75 ml kan -, kültür slaytlar, CD16 (Şekil 2F) için boyandı ve bundan sonra, 30 dakika boyunca sürdürüldü görüntülenmiş ve CD16 + hücrelerinin sayısı hesaplandı edildi. CD16 + hücrelerin işe 1.5 ml kan ile 100 256 CD16 + hücre / mm 2 (p &lt;0.0001) ve TNFa tedavisi (Şekil 2E) ile önemli ölçüde artmıştır ve 172 1.75 ml kan ile 378 (P &lt;0.0001). TAT komplekslerin oluşumu ya da TNFa, işlenmiş ve işlenmemiş hücreleri (Şekil 2G) ile inkübe kan ilgili plazma örneklerinde ölçülmüştür. Muamele edilmemiş hücreler ile karşılaştırıldığında, TNFa uyarılmış hücrelerin TAT komplekslerinin yaklaşık iki katına çıkmasına neden oldu. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Incirobilyaları 2: Kan endotel hücre odası modeli İşlevsellik. CHS olan veya olmayan (A), Chambers, tam kan ile inkübe edildi. CHS olmadan, bir pıhtı 30 dakika sonra kuruldu. CHS yokken kuluçkaya kanda trombin antitrombin (TAT) kompleksleri, pıhtılaşma dolaylı işaretleyici, ölçülmesi&gt; 6000 ug / ml idi. (B), kan hacmi, farklı kan miktarı değişecektir, dönen hava kabarcığı hareket muhafaza. Bu 1.75 ml ilavesi ile 0.74 ml artacak ise kan 1.5 ml ilave edilmesiyle, bu hacim, 0.3 ml olacaktır. Konfluent tek tabaka faz kontrast mikroskopisi, tipik olarak endotel hücre morfolojisi önce (C), HUVEC görüntülü farklı kan hacimleri eklendiğinde kan teması. (D) tamamen CHS kaplı odaları için TAT değerleri hafif bir farklılık göstermektedir. 1.5 ml kan ilave 85 sonuçlandı 1.75 ml e ± 11 ug / ml (n = 7) göre 35 ile sonuçlanmıştır77; 70 ug / ml, TAT (s = 8). HUVEC aynı kan hacmi ile kuluçkaya yatırılır, bu fark, artık mevcut değildir; 1.5 ml 66 ± 55 ug / ml (n = 5) ve 66 ± 29 1.75 ml (n = 7), uyarılmamıştır ve TNFa ya da üzerinde CD16 + hücrelerinin sayısı. (D) miktarının belirlenmesi, mevcut sonra HUVECler uyarımlı için ug / ml kan teması. Ya da 1.75 ml (bazal:;: TNFa ya da 1.5 ml (256 ± 121 hücre / aa TNFa 100 ± 40 hücre / mm bazal) ile inkübe edilen hücreleri stimüle olan CD16 + hücre sayısı önemli ölçüde artmıştır 172 ± 67 hücre / mm; TNFa: tam kan, 378 ± 185 hücre / mm) (F), HUVEC falloidin (kırmızı için boyandı stimüle stimüle edilmemiş ve TNFa temsili görüntüleri), CD16 (yeşil) ve DAPI (mavi).. Ölçü bar = 250 um kan (1.5 mi ile inkübe edilen, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla TAT komplekslerin formasyonu yaklaşık TNFa ile iki katına (G) hücreler uyarılmış. 2.1 ± 0.1 kat daha fazla TAT, n = 3; 1.75 mi: 1.7 ± 1.0 kat daha fazla TAT, n = 4). Tüm değerler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; p değerleri eşleşmemiş t testi ile hesaplanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium at JoVE.com

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K Görüntüleme.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Video: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI&#39;nin Gelişimi ve Kimlik<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...