Bağırsaktaki M hücrelerinin nadirliği nedeniyle, Bağırsak homeostazve bağışıklık savunmasında M hücrelerinin oynadığı rolün tam olarak anlaşılması eksiktir. İnsan bağırsak kök hücre türetilmiş kültürlerde M hücrelerinin indüklenen farklılaşması M hücre gelişimi ve fonksiyonlarının incelenmesine olanak sağlayacaktır. Transwell membranları kaplamak için, iki odasistemi oluşturarak, 24 kuyu plakası içine istenilen sayıda Transwellyerleştirin.
Ekstrasellüler matriks seyreltin, veya ECM, soğuk steril fosfat tamponlu tuzlu 25 kat. Daha sonra, membran üzerine her üst hazneiçine soğuk seyreltilmiş çözelti 100 mikrolitre ekleyin. Kapak 24 kuyu plaka bir kapak ile, ve membran üzerinde ECM katılaşma izin vermek için iki saat boyunca 37 santigrat derece bir doku kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin.
İki saat sonra, kuvözden plakayı çıkarın ve bir doku kültürü başlığı yerleştirin. Steril cımbız kullanarak, kalan çözümü nazikçe çıkarmak için her Transwell'i ters çevirin. Hücreler toplanırken kapakları açık olan kaputta membranların kurumasını bekleyin.
Ileal enteroidlerin plakasını kuvözden çıkarın ve vakum aspirasyonu veya pipetle kültür ortamını her kuyudan nazikçe çıkarın. ECM'yi parçalamak için, ECM'de asılı olan ileal enteroidleri içeren her kuyuya 500 mikrolitre buz soğuğu 0,5 milimolar EDTA ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı bir P1000 pipet tervet ile şiddetle 500 mikrolitre ECM kırmak için ayarlanmış, bu nedenle çözelti içine ileal enteroidler serbest.
15 mililitrekonik tüpler içine her kuyudan çözüm toplayın. 140G'de bir santrifüjdeki hücreleri peletleyin ve dört santigrat dereceye beş dakika. Pelet görünür olmalıdır, ancak kolayca yerinden olabilir, bu yüzden yavaş yavaş vakum aspirasyon veya bir pipet ile supernatant kaldırın.
Sıkı kavşak bağlantılarını sindirmek ve ileal enteroidleri tek bir hücreye ayırmak için, toplanan her beş kuyuda 500 mikrolitre oda sıcaklığında tripsin peleti yeniden askıya alın. Bir P1000 pipetter kullanarak, pipet yukarı ve aşağı kümeleri ayrıştırmak için. Tüpleri 37 derece lik bir su banyosunda beş dakika veya daha kısa bir süre kuluçkaya yatırın.
Trypsin'i inaktive etmek için 500 mikrolitre trypsin başına %10 FPS ile bir mililitre gelişmiş DMEM F-12 ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 500 mikrolitre 500 mikrolitre konik tüp tarafında karşı en az 50 kez tek hücrelere kalan kümeleri daha ayrıştırmak için ayarlanmış bir P1000 ile. 50 mililitrelik konik tüpün üzerine 40 mikronluk bir süzgeç yerleştirin ve hücre süzgecini ıslatmak için %10 FPS ile bir mililitre gelişmiş DMEM F-12 ekleyin.
Pipet süzgeç üzerine 15 mililitre konik tek hücre süspansiyon. Süzgeci bir mililitre gelişmiş DMEM F-12 ile %10 FPS ile yıkayın. Hücre süzgecinden geçen hücreleri 50 mililitrelik konik tüpten yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Hemositometre kullanarak hücreleri say. Oda sıcaklığında beş dakika 400G yeni 15 mililitretüp hücreleri santrifüj. Hücre pelet görünür olmalıdır.
Dikkatle bir pipet ile supernatant kaldırmak, tekrar pelet yerinden olur durumda supernatant kaydedin. 10 mikromolar Y27632 ile MCMGF artı hücre pelet resuspend. ECM kodlu membranların gözle değerlendirildiği şekilde tamamen kurutulduğunu sağlayın.
Üst hazneyi 200 mikrolitre MCMGF artı ile yıkayın. Daha sonra, her üst odaya 200 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin. Her alt hazneye 700 mikrolitre MMMGF artı 10 mikromolar Y27632 ekleyin.
Plakayı %5 CO2 ile 37 derece santigrat doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Büyüme bir gün sonra, üst odasından medya kaldırmak ve taze MCMGF artı 200 mikrolitre ile birden fazla hücre katmanlarının büyümesini önlemek için değiştirin. Monolayers yaklaşık% 80 confluent, genellikle gün 1-3 post tohumlama arasında, kontrol kuyuları için farklılaşma ortamı ile basilateral medya değiştirin, ya da M hücre indüksiyon kuyuları için M hücre li media ile.
Her iki koşul için de üst odadaki ortamı farklılaştırma ortamıyla değiştirin. QRTPCR tarafından M hücre farklılaşmasını doğrulamak için, önce ortamı üst ve alt bölmelerden çıkarın. Üst hazneyi oda sıcaklığında 300 mikrolitre PPS ile iki kez hafifçe yıkayın.
Her üst odaya 300 mikrolitre TRIzol ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Bu arada, etiket mikro santrifüj tüpler her kuyu için, ve her tüp için TRIzol 700 mikrolitre ekleyin. P1000 ile üç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak hücre homojenate'i toplayın ve içindekileri ilgili mikro santrifüj tüplerine aktarın.
Girdap'ı karıştırmak için beş saniye. Numuneleri oda sıcaklığında üç dakika daha tutun ve ardından standart QRTPCR protokolleriyle devam edin veya numuneleri negatif 80 santigrat derecede saklayın. İmmünfloresan ile M hücre farklılaşmasını doğrulamak için, ilk olarak, üst odadan medya kaldırın.
300 mikrolitre oda sıcaklığında PBS ile iki kez hafifçe yıkayın. Üst hazneye PBS'de 100 mikrolitre oda sıcaklığında %4 PFA ekleyin. Folyo ile plaka kapağı ve oda sıcaklığında 25 dakika bekletin.
PFA'yı çıkardıktan sonra üst hazneyi 300 mikrolitre oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın. Çözeltiyi çıkarmadan önce monokatmanları engellemek için 100 mikrolitre %5 BSA ile monokatmanları oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca çözünmüş monokatmanları kuluçkaya yatırın. GP2 primer antikor çözeltisini PBS'de yüzde bir BSA'da 1 ila 100 arasında seyreltme ile hazırlayın ve kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin.
Çözeltiçıkarmadan önce, karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca leke. Oda sıcaklığında 300 mikrolitre PBS ile üst hazneyi üç kez yıkayın. Floresan etiketli keçi anti-fare IgG phalloidin ve DAPI ikincil bir leke çözeltisi hazırlayın ve kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin.
Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika leke. 300 mikrolitre PBS ile kuyuları üç kez yıkayın. Daha sonra, bir cam slayt üzerine montaj çözeltisi beş mikrolitre damla yerleştirin.
24 kuyu plaka ve ters kuyu çıkarın. Transwell membran kaldırılması sırasında, membran tamamen düz kalmalıdır. Membrandaki çıkıntılar cam kaydırağa sağlam bir mühür girmesini önler ve görüntü kalitesini büyük ölçüde etkileyebilir.
Başarıyı sağlamak için, keskin bir neşter kullanarak membranı dikkatlice kuyudan kesin. Membranı, cam kaydırak üzerine montaj çözeltisinin damlacıklarına kadar bakacak şekilde yerleştirin. Membranın üst ve ortasına 10 mikrolitre montaj çözeltisi ekleyin ve membranı cam kaydırak ile kapak fişi arasına kapatmak için üzerine bir kapak fişi yerleştirin.
24 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında slaytlar kuru. M hücreleri immünofloresanslar tarafından GP2 yüzey ekspresyonu ile tespit edilir. Tipik olarak, bir konfluent monolayer, bir ila beş M hücreleri rankl ve TNF alfa ile tedavi örneklerinde altı ila sekiz post tohumlama gün altı tarafından 40X büyütme belirli bir mikroskop alanında gözlenir.
İşlenmemiş örneklerde GP2 ifadesi görülmez. Bir penisoidin sondası ile kapatılan XZ düzleminin ortogonal görünümü, her hücreyi çevreleyen aktin yapılarını ve M hücrelerinin apikal yüzeyinde GP2 ifadesini gösterir. Bu model, insan bağırsağı bulunan M hücrelerinin düşük frekansını özetler.
Bu modelde geliştirilen M hücrelerinin IgA'ya bağlanıp bağlanabildiğini belirlemek için, M hücrelerinde IgA varlığı, insan serumu IgA'nın ağır zincirini tanıyan bir flor konjuge ikincil antikor kullanılarak görselleştirilmiştir. Bir saat boyunca IgA ile tedavi edilen M hücreleri IgA'ya apikal yüzeye bağlıdır, oysa sadece IgA'ya ikincil antikor ile tedavi edilen kontrol kuyularında bulunan M hücreleri tespit edilebilir bir sinyale sahiptir. Ayrıca, IgA özellikle M hücrelerinin apikal yüzeyine bağlanır ve GP2 yüzey lekesi olmayan herhangi bir hücreye bağlı bulunmaz.
Buna ek olarak, M hücrelerinin apikal yüzeyinde karakteristik olarak daha kısa yoğun aktin bulunur. Monolayers yaklaşık% 80 confluent olduğunda RANKL TNF alfa tamamlayıcı farklılaşma medyaya geçiş, iyi M hücre farklılaşması elde etmek için anahtardır. Bu teknik, araştırmacıların M hücre gelişimiile ilgili soruları araştırmalarına ve M hücrelerini içeren patojen etkileşimlerini ve ilaç taşıma çalışmalarını araştırmalarına olanak sağlayacaktır.
