Bu protokol, makrofaj fonksiyonunu manipüle etmek ve değerlendirmek için larva zebra balığı makrofajlarını ilgilendiren ilaçları hedefleyen bir tekniği açıklamaktadır. Bu teknik, ilaçların özellikle lipozom kapsülleme yoluyla makrofajlara yönelik olmasını sağlayarak geleneksel ilaç dağıtım stratejilerine göre avantajlıdır. İnflamatuar bir bileşene sahip zebra balığı modellerine uygulandığında, bu teknik makrofajların patolojik süreçlere nasıl katkıda bulunduğunu çözme potansiyeline sahiptir.
Burada, aktivasyonu bastırmak için makrofajlara mitokondriyal-reaktif oksijen türlerini inhibe eden bir ilacı hedef leyerek bu tekniğin yararını gösteriyoruz. Larvaiçine ilaç yüklü lipozomların mikroenjeksiyonu zor olabilir, çünkü aşırı epitel hasarına yol açmamaya özen gösterilmiştir, bu da immünolojik çalışmaları etkileme potansiyeline neden olabilir. Bu protokolün görsel gösterimi önemlidir, çünkü tek bir laboratuvarda rutin olarak yapılmayan farmakolojik ve tüm hayvan canlı hücre metodolojilerini içerir.
25 mililitrelik yuvarlak alt şişede 10 miligram lipozom hazırlamak için, 31 deniz mavisi nanomolar ve şişeye 300 nanomolar bir mitokondriyal-reaktif oksijen türü inhibe edici ilaç ekleyin. Tam olarak çözünmek için kısa bir süre sonicate ve vakum basıncı altında dakikada 75 rotasyonlar 45 derece santigrat su banyosu üzerinde ayarlanmış bir döner buharlaştırıcı yavaş yavaş çözücü kaldırın. Şişenin cam duvarları içinde kuru bir lipid ince film oluştuğunda, organik çözücünün tamamen çıkarılmasını kolaylaştırmak için filmi azot altında 45 dakika daha fazla kurutun.
Daha sonra, filmi bir mililitre PBS ile nemlendirin ve şişeyi 60 derecelik santigrat su banyosunda 20 dakika boyunca elle çalkalamadan önce şişeyi parafin filmle kapatın. Donma ve erime yedi döngüsonra, iki ila altı döngü için lipozomlar ekstrüzyon için bir mini ekstrüzyon ve bir mikrometre parça kazınmış polikarbonat membranlar kullanın. Büyük unilamellar veziküller elde edildiğinde, ultracentrifugation tarafından bir pelet içine taze lipozomlar yoğunlaştırmak.
Peleti bir mililitre 1%poloxamer 188 çözeltisi ile 45 santigrat derecede 30 dakika ve iki mililitrelik mikrosentrifüj tüp ekine sahip bir ThermoMixer'da dakikada 750 dönüşle inkübedin. Lipozomlar içine poloxamer 188 post ekleme sırasında, doğru poloxamer konsantrasyonu, kuluçka süresi, ve sıcaklık ortaya çıkan lipozomların optimal fizikokimyasal özellikleri elde etmek için önemlidir. Kuluçka sonunda, ultracentrifuge karışımı tekrar aynı santrifüj koşulları altında, ve herhangi bir sınırsız polimer veya ilaç içeren supernatant kaldırın.
Sonra ışıktan korunan, dört santigrat derece lipozom pelet saklayın. Lipozomların boyutunu ve zeta potansiyelini belirlemek için lipozom formülasyonuna ultra saf su ile bir-100 oranında seyreltin. Parçacık boyutunu, çok dağılım indeksini ve 25 santigrat derecede triplicate'deki zeta potansiyelini ölçmek için dinamik bir ışık saçılımı çözümleyicisi kullanın.
Tuzak verimliliğini ve lipozomların ilaç yüklemesini hesaplamak için Triton X-100'deki lipozomları çözün. Çözünmüş lipozom numunesinin 20 mikrolitresini, kuaterner pompa, 230 nanometre de ayarlanmış bir diyot dizi dedektörü ve üç mikrometre, 250-4,6 milimetrelik bir kolon ile yüksek basınçlı sıvı kromatografi sistemine enjekte edin. Enjeksiyon için transgenik zebra balığı larvaları hazırlamak için, döllenme sonrası 30 saat embriyoları elle dechorionate ve embriyoların iki gün sonra döllenme sonrası kadar 28,5 santigrat derecede gelişmesini sağlamak için ince uçlu forsepskullanın.
Embriyolar uygun aşamaya ulaştığında, steril PBS'de bire bir oranında yeni hazırlanmış lipozom formülasyonu seyreltin ve girdap yaparak çözeltiyi 2-3 saniye karıştırın. Tüm yüzeyi kaplayan ince bir film oluşturmak için küçük, 35 milimetrelik kültür çanak kapağının kapağına E3 ortamında yeterli %3 metil selüloz dökün. Yaklaşık 20-25 anestezi larvaları bir havuz toplamak için plastik transfer pipet kullanın.
Embriyoların ağırlık olarak pipetin ucunda konsantre olmasını bekleyin ve larvaları en az çözeltiyle 35 milimetrelik kültür kapağının ortasına dikkatlice aktarın. Arka beyin ventriküliçine enjeksiyon için mikroenjeksiyon iğnesi doğru bakan dorsal yüzeyi ile enjeksiyon plakasının üst doğru onların ön leri ile larvadüzenlemek için bir mikrokapiller yükleyici kullanın veya sinüs venöz içine enjeksiyon için mikroenjeksiyon iğne doğru bakan vevant yüzeyleri ile enjeksiyon plakasının soluna doğru ön leri ile. Lipozom enjeksiyon karışımı yaklaşık beş mikrolitre ile geri bir enjeksiyon iğnedoldurmak için bir mikrocapiller yükleyici kullanın.
İğneyi manyetik bir standa ve basınç enjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin ve kurulumu stereo mikroskop altında yerleştirin. Çapı yaklaşık beş mikrometrelik bir açıklık oluşturmak için mikroenjeksiyon iğneucu kesmek için temiz, ince uçlu forceps kullanın. Enjektörü yaklaşık 50 milisaniyelik bir darbe süresine ve inç kare başına yaklaşık 40 pound'luk bir enjeksiyon basıncına ayarlayın.
Enjekte edilecek hacmi kalibre etmek için bir hemositometrenin ızgara hatları üzerinde konumlandırılmış mineral yağ bir damla içine bir bolus enjekte. Daha sonra nabız süresini ve/veya enjeksiyon basıncını bolus çapı en küçük ızgara hatlarının 2 1/2'sini kaplayana kadar ayarlayın. Lipozom enjeksiyon karışımından bir nanolitresini her larvanın arka beyin ventrikülüne dikkatlice enjekte edin.
Enjeksiyonları hemen takiben, enjeksiyon plakasına E3 orta ekleyin ve larvaları metil selülozdan hafifçe çıkarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın. Bir su daldırma lens ile donatılmış bir konfokal mikroskop üzerinde arka beynin sırt yüzeyini görüntülemek için, ilk montaj ortamı ile beş milimetre lik bir derinliğe kadar 35 milimetrelik bir kültür çanak doldurun ve orta polimerize sağlar. Deneysel embriyonun yumurta kesesini yerleştirmek için yeterli alanın agarose küçük bir siper kazmak ve bir anestezi larva toplamak için erimiş montaj ortamı ile dolu plastik bir transfer pipet kullanın.
Hemen kültür çanak içine larva mevduat ve kazılmış delikler içine yolk kese ventral tarafı yönlendirmek için bir mikrokapiller yükleyici kullanın. Agarose polimerize olana kadar embriyoyu bu pozisyonda koruyun. E3 orta ile embriyo bindirme triain mililitre başına 200 mikrogram ile takviye.
Görüntüyü canlı olarak arka beyin ventrikülünü canlı olarak seçin ve konfokal mikroskobu 512 piksel ve 2,5 x yakınlaştırmaya ayarlayın. Mikroskop parametreleri ayarlandığında, mavi floresan lipozomları ve yeşil floresan makrofajları görüntülemek için iki kanallı görüntüleme kullanarak arka beynin en fazla yüzeyinden uzanan 40'a üç mikrometrelik Z-yığınları edinin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, dosyaları uygun bir 3D görüntü analizi yazılımı programına yükleyin.
Ölçüm sekmesialtında, Ölçümler alanını açmak için Nesneleri Bul protokolünü Burada Sürükle Görevleri'ne sürükleyin. Lipozomları vurgulamak için DAPI kanalını seçin ve lipozom yüklü makrofajları algılamak için Inspect aracını Z bölümleri ne kadar sürükleyin. Tek tek hücrelerdeki lipozomların floresan yoğunluğunu ölçmek için, Ölçüleri Ölçme Alanı'na Çekmek Için İlgi Alanları protokolüne Klibi sürükleyin ve X, Y ve Z boyutlarındaki ilgi hücresinin etrafına bir kutu çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın.
Ardından, kitaplık penceresinde bir ölçüm dosyası oluşturmak için Ölçümler açılır menüsünden Ölçüm Öğesi Oluştur'u seçin. Bu tabloda üretilen lipozomların büyüklüğü, zeta potansiyeli, ilaç yüklemesi ve tuzak etkinliği özetlenmiştir. Görüldüğü gibi, lipozomların partikül boyutu ilaç yüklemesi ile benzer ve ilaç yüklemeolmadan, ilaç yüklü lipozomların yüzey yükü sadece deniz mavisi kontrol lipozomlarından biraz daha nötr olmasına rağmen.
Arka beyin ventrikül içine deniz mavi etiketli lipozomların mikroenjeksiyon, gösterildiği gibi, kolayca konfokal mikroskopi ile üç saat sonra enjeksiyon sonrası ölçülebilir yerleşik makrofajlar tarafından hızlı bir alım ile sonuçlanır. Nötrofiller, ancak, nadiren hücre içi lipozomlar içeren gözlenmiştir. Bireysel lipozom yüklü makrofajlar içinde, lipozomlar fagolysomal kompartmanlar içinde birikir, hangi lipozom bozulması ve sitoplazma içine sonraki ilaç içeriği serbest bırakılması için gereklidir.
Sinüs venöz içine teslim dolaşım yoluyla kaudal hematopoetik doku yerleşik makrofajlar için lipozomlar teslim edebilirsiniz. Mitokondriyal-reaktif oksijen türlerini inhibe eden ilaçla arka beyin ventriküle yüklenen lipozomların mikroenjeksiyonu, lipozom yüklü hindbrain-resident makrofajlar içinde monosodyum ürat kristal güdümlü mitokondriyal-reaktif oksijen türlerinin üretimini önemli ölçüde baskılayabilir. Makrofaj aktivasyon durumları üzerinde ilgi ilaçların bastırıcı etkileri nin daha fazla doğrulama yerinde hibridizasyon ve nötrofillerin zamansal işe bütün montaj tarafından proinflamatuar sitokin gen ekspresyonu araştırArak yapılabilir.
Bu tekniği kullanarak, bir immünometabolik mekanizmanın akut gut iltihabı larva zebrabalığı modelinde aktivasyonlarını yönlendirdiğini doğrulamak için ilaçları makrofajlara yöneltebildik. Bu protokolün gelecekteki uyarlamaları, makrofaj hedeflemesini geliştirmek veya nötrofiller gibi diğer bağışıklık hücrelerine hedeflemeyi teşvik etmek için lipozomun yüzey modifikasyonunun yapılmasını içerebilir.
