Burada açıklanan protokol, bir kemokinin işlevini ve in vivo makrofaj davranışını araştırmamıza olanak sağlar. Hücre kemotaksismevcut deneysel modellerin çoğu in vitro hücre deneyleri dayanmaktadır. Ama in vitro deneyler bazen in vivo karmaşık ortamı modellemek için çok basittir.
Ayrıca, in vivo kemoattraction yeteneğini temsil olmayabilir. Bu yöntemler, fareler için zor olan doğrudan hücre davranışı gözlemi için zebra balığının özel avantajını kullanır. TGFABP-10A interlökin-34 transgenik yapılar üreterek başlayın.
FABP-10A interlökin-34'ü transposaz MRNA ile birlikte bir hücre evresine enjekte edin Tg (mpeg1:GFP)transgenik ve yabani tip balık embriyoları halinde bir hücre evresine dönüştürün. El yazması talimatlara göre embriyoları toplayın ve kaldırın. Daha sonra, 4 santigrat derece veya oda sıcaklığında iki saat boyunca gecede% 4 paraformaldehit ile düzeltin.
Fiksasyondan sonra embriyoları pbst ile üç kez yıkayın ve beş dakika yıkayın. PBST%50 metanol ile ayrı ayrı embriyoları kurutun, ardından %100 metanol, sonra taze %100 metanol değiştirin ve en az 2 saat negatif 20 santigrat derecede saklayın. Sonda hibridizasyonu için hazır olduğunuzda, PBST%50 metanol ile embriyoları ayrı ayrı yeniden sulendirin.
Daha sonra, yıkama başına beş dakika pbst ile üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında PBST proteinaz K ile embriyosi sindirin. Daha sonra, sindirim çözeltisi atın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile fiksasyon tekrarlayın.
Fiksasyondan sonra embriyoları pbst ile iki kez yıkama başına 10 dakika yıkayın. En az bir saat boyunca 65 santigrat derecede ısıtmalı hibridizasyon tamponu ile prehibridizasyon gerçekleştirin. Daha sonra interlökin-34 sondasını 10 dakika boyunca 65 dereceye ısıtın.
Hibridizasyon tamponunu orijinal tüpe geri dönüştürün ve bir gecede önceden ısıtılmış sondayla 65 santigrat derecede hibridizasyon gerçekleştirin. Ertesi gün, embriyoları %50 formamid ve 2X SSCT ile yıkayın ve ardından 2X SSCT ve ardından 65 santigrat derecede 0.2X SSCT. Her yıkama başına 20 dakika ile üç kez tekrarlayın.
Daha sonra embriyoları PBST ile üç kez yıkayın ve her yıkama başına beş dakika yıkayın. 600 mililitre bloke tamponu ile numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca engelleyin. Sonra, anti-digoksigenin HRP antikor çözeltisi 400 mikrolitre ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat embriyolar inkübün.
Ertesi gün, antikor kaldırmak ve yıkama başına 20 dakika PBST ile altı kez embriyoları yıkayın. Son yıkamadan sonra, her numuneyi 30 mikrolitre 1X artı amplasyon dilüentile beş dakika durulayın. Florofor tiramin çalışma çözeltisi içinde örnekleri karanlıkta 5 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Sinyaller zayıfsa kuluçka süresini 30 dakikaya uzatın. Daha sonra embriyoları PBST ile üç kez yıkayın ve 10 dakika yıkayın. Ve onları bir gecede dört santigrat derecede birincil antikorla kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, embriyoları pbst ile beş kez yıkama başına 30 dakika yıkayın ve bir gecede dört santigrat derecede ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, yıkama başına 10 dakika PBST üç kez embriyoyıkamak ve daha uzun süre dört derece santigrat veya negatif 20 derece santigrat karanlıkta% 70 gliserol onları saklayın. Görüntülemeden önce, DS kırmızı ve GFP çift pozitif embriyoları seçmek için floresan mikroskobu kullanın.
Balık monte etmek için, 90 santigrat derece üzerinde% 1 düşük erime agarose bir mililitre ısıtmak için bir metal banyo kullanın. Sonra, vücut ısısına soğutun ve% 0.2 tricaine 50 mikrolitre karıştırın. Anestezili embriyoları alt tabakada bir kapak slaytı ile monte edilmiş küçük bir tabağa aktarın.
Çevreleyen su çıkarın ve yavaş yavaş embriyolar üzerinde düşük erime agarose bırakın. Dikkatle agarose katılaşmış önce balık konumunu ayarlayın, kapak slayt yakın karaciğer alanı tutarak. Bir kez agarose katılaşmış, dikkatle agarose başka bir tabaka ile kapsayacak şekilde güçlendirmek için.
Kabı konfokal mikroskop taşıyıcı masasına yerleştirin, balığı ntrikal ile E2 çözeltisi ile kaplayın ve görüntülemeye başlayın. Konfokal mikroskobu çalıştırmak için Zen Black 2.3 yazılımını açın ve bul'u, sonra kuluçkayı tıklatın ve sıcaklığı 29 dereceye ayarlayın. Edinme menüsüne tıklayın ve akıllı kurulum menüsünde gerekli tetkik modunu ve lazerleri seçin.
Sonra Z-yığını nı ve konumunu seçin. Deneysel tasarımcı menüsüne tıklayın ve düşük büyütme altında örnek bulmak için ilk blokta çoklu blok deney etkinleştir'i seçin. Daha sonra, yüksek büyütme geçmek ve görme alanının merkezinde gözlenen alan sağlar.
Konumu ve Z-yığın bilgilerini ayarlayın. Ardından, uygun lazer yoğunluğunu, tarama katmanlarını ve görüntüleme hızını seçin. Tüm bloklar ayarlandıktan sonra, uygun döngü sayısını ayarlayın ve kaydetmeye başlayın.
Bu protokol, makrofajları GFP ile etiketlenen transgenik balık embriyolarına ekspresyon plazmidi üzerine karaciğere özgü interlökin-34 enjekte etmek için kullanıldı. Interlökin-34 ve GFP etiketli makrofajların ekspresyonunu analiz etmek için yerinde tam montaj floresanve immünboyama kullanıldı. Makrofaj hücre sayıları enjekte edilmemiş embriyoların karaciğer ve kuyruk bölgesinde nicel olarak analiz edildi ve yapılandı.
Canlı görüntüleme, kontrol eden bir balığın karaciğerinden geçen ve balıkları ifade eden bir interlökin-34'ün karaciğerine göç eden, yeşil etiketli makrofajları doğrudan gözlemlemek için kullanıldı. Bu protokolün önemli adımları ilgi hücre etiketlemek için uygun bir transgenik hat seçimi içerir. Transgenik gen ekspresyonunuzun görüntülenmesi için uygun doku ve uygun bir gözlem süresi penceresi.
Bu teknik, diğer kemokinlerin işlevini t-hücreleri ve nötrofiller in vivo gibi diğer hücrelerin davranışı üzerine incelemek için uygulanabilir.
