Hücre-hücre etkileşiminin hücre davranışları üzerindeki etkisini anlamak için yakalama verimliliğini dinamik canlı hücre görüntü gözlemi ile etkili bir şekilde birleştirmek çok önemlidir. Bu tüp, daha büyük bir odada birden fazla tek hücreyi verimli bir şekilde yakalayabilir ve birden fazla tek hücreli etkileşim davranışının dinamik takibi için yeterli kültürleri temellendirebilir. PDMS aygıtını hazırlayarak başlayın.
Bir kurutucu triklorosilane 100 mikrolitre ile tartım çanak bir gofret kalıbı yerleştirin ve 15 dakika boyunca bir vakum uygulayın. Vakum durdurun ve en az bir saat boyunca 37 santigrat derece de kurutucu gofret kalıbı salisil. PDMS tabanını ve PDMS kür ajanını 10'a 1 oranında karıştırın, ardından 15 santimetrelik bir tabaktaki gofret kalıbına toplam 20 gram karışımı dökün.
Bir kurutucu içine 15 santimetre çanak yerleştirin ve bir buçuk dakika için bir vakum uygulayın. Sonra kurutucu dan çanak çıkarın ve azot gazı ile PDMS artık hava kabarcıkları ortadan kaldırmak. 2-4 saat boyunca 65 santigrat derece bir fırında çanak yerleştirerek PDMS Cure.
Bittiğinde, gofret kalıbından PDMS kopyasını çıkarın ve PDMS'de 1,5 milimetrelik giriş ve 0,5 milimetrelik bir çıkış noktasını delin. PDMS yinelemesini ve slayt yüzeyini çıkarılabilir bantla temizleyin. Oksijen plazma ile yüzey tedavi edin.
Ardından, PDMS yinelemesini slaytla el ile hizalayın ve birbirleriyle temas edin. PDMS slaytını 65 derece santigrat fırında bir gün bekletin. Ertesi gün, PDMS aygıtını PBS ile dolu bir kapta batırın.
Kurutucuiçine yerleştirin ve 15 dakika vakum uygulayın. Cihazı bir hücre kültürüne taşıyın ve UV ışığıyla 30 dakika sterilize edin. PDMS cihaz arabelleği orta ile değiştirin ve bir gün için dört derece santigrat de inkübün.
Hücreler %70 ila %80 biraraya geldiğinde, kültür ortamını çıkarın ve beş mililitre PBS ile yavaşça üç kez yıkayın. WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerine bir mikromolar floresan boya içeren bir mililitre DMEM/F-12 ortamı ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra hücreleri beş mililitre steril PBS ile üç kez hafifçe yıkayın, PBS'yi çıkarın ve %0.25 Tripsin-EDTA'dan iki mililitre ekleyin.
Oda sıcaklığında dört dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın, sonra yavaşça hücre müfrezesini teşvik etmek için kültür çanağı dokunun. WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerini dağıtmak için dört mililitre DMEM/F-12 ortamı ekleyin, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 300 xg'de üç dakika santrifüj edin. Süpernatant'ı çıkarın ve hücre peletini bir mililitre DMEM/F-12 orta sında yavaşça yeniden askıya alın.
Mililitrede mililitrelik bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve hücre agregasını önlemek için buzda tutun. Polytetrafloroetilen tüpü cihazın çıkışı ile şırınga pompası arasında bağlayın. Ortamı çıkarın ve hazırlanan hücre süspansiyonunun bir mikrolitresini PDMS aygıtının girişine ekleyin.
Daha sonra, dakikada 0,3 mikrolitre akış hızında bir şırınga pompası kullanarak cihaza hücre süspansiyon yükleyin. Cihazın girişine bir mikrolitre DMEM/F-12 ortamı ekleyin, ardından bir şırınga pompası kullanarak ortamı cihaza yükleyin. Dakikada 10 mikrolitre akış hızında şırınga pompası ile cihaza 0,3 mikrolitre DMEM/F12 ortamı yükleyin.
Hücreler yüklendikten sonra tüpü çıkarın ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için giriş ve çıkışı pololefin bantla kapatın. PDMS cihazını 10 santimetrelik bir kültür yemeğine taşıyın ve ortamın buharlaşmasını önlemek için cihazın etrafına 10 mililitre steril PBS ekleyin. Kültür çanamasını üçlü tek hücreli kültür için bir kuvöze aktarın.
PDMS aygıtı, kültür odasına ve bypass kanalına bağlanan bir yakalama sitesi olan üç katmanlı bir yapıya sahiptir. Kültür odası ve bypass kanalı arasındaki akış direnci farkı hücrenin yakalama konumuna akmasını sağlar, bu da aşağıdaki hücrenin bypass kanalından bir sonraki yakalama bölgesine geçmesine neden olur. Reflü adımı hücreyi yakalama alanından serbest bırakmak ve kültür odasına göndermek için kullanılır.
Bu protokolün hücre yakalama etkinliği üç farklı hücre tipinde değerlendirildi. İnsan lenfatik endotel hücreleri, veya LECs, insan oral skuamöz hücreli karsinom T2.6 hücreleri WNT5B-spesifik kısa saç tokası RNA ifade hücreleri, ve pLKO-GFP vektör kontrol hücreleri. Gösterilen üç hücrenin tek hücreli yakalama etkinliği LEC'ler için yaklaşık %71, WNT5B sh4 hücreleri için %74 ve pLKO-GFP hücreleri için %78 idi.
Üçlü tek hücreli yakalama verimi %48 idi Bu yöntem lenfatik endotel hücreleri ve skuamöz kanser hücrelerinin birden fazla tek hücreli ko-kültürleri için kullanılabilir ve hücrenin çoğalması ve morfolojisi mikroskop altında gözlemlenebilir. Hazırlanan hücre süspansiyonlarının en az hücre agregasına sahip olduğundan emin olmak önemlidir, çünkü hücre agregaları sadece tek eşleştirme verimliliğini azaltmakla kaynıp mikro kanalları tıkayabilir. Tek tek hücreler arasındaki hücre-hücre etkileşimi hücre davranışlarının kontrolünde önemli bir rol oynar.
Yöntemimiz, araştırmacıların hücre-hücre etkileşimini tek bir hücre düzeyinde incelemelerine yardımcı olmak için etkili bir araç sağlayabilir, bu da nüfusa dayalı çalışmalardan kolayca elde edilemeyen yeni mekanizmaların keşfedilmesine yol açabilir.
