Очень важно эффективно сочетать эффективность захвата с динамическим наблюдением изображения живой клетки, чтобы понять влияние взаимодействия клеток и клеток на поведение клеток. Эта трубка может очень эффективно захватывать несколько одиночных ячеек в большей камере и обеспечивать достаточную основу культур для динамического отслеживания поведения нескольких одноклеточных взаимодействий. Начните с подготовки устройства PDMS.
Поместите вафельную форму в блюдо для взвешивания со 100 микролитров трихлоросилана в desiccator и применить вакуум в течение 15 минут. Остановите вакуум и засолить форму пластины в опреснении при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере один час. Смешайте pdMS базы и PDMS лечения агента в соотношении 10 к одному, а затем залить в общей сложности 20 граммов смеси на вафельную форму в 15-сантиметровой тарелке.
Поместите 15-сантиметровое блюдо в десикатор и нанесите вакуум на полтора минуты. Затем снимите блюдо с децикатора и устранить остаточные пузырьки воздуха в PDMS с азотным газом. Лечить PDMS, поместив блюдо в духовку при температуре 65 градусов по Цельсию в течение двух-четырех часов.
После завершения, удалить реплику PDMS из вафельной формы, и удар 1,5-миллиметровый вход и 0,5-миллиметровый выход на PDMS. Очистите реплику PDMS и поверхность слайда съемной лентой. Лечить поверхность кислородной плазмой.
Затем вручную выровнять реплику PDMS с слайдом и привести их в контакт друг с другом. Оставьте слайд PDMS в духовке 65 градусов по Цельсию на один день. На следующий день погрузите устройство PDMS в контейнер, наполненный PBS.
Поместите его в desiccator, и применять вакуум в течение 15 минут. Перемести устройство на капот клеточной культуры и стерилизовать его ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. Замените буфер устройства PDMS на средний и инкубировать его при четырех градусах по Цельсию в течение одного дня.
Когда клетки достигают 70 до 80% слияния, удалить культуру среды и аккуратно мыть их три раза с пятью миллилитров PBS. Добавьте один миллилитр среды DMEM/F-12, содержащий один микромолейный флуоресцентный краситель, в клетки WNT5B sh4 и pLKO-GFP и инкубировать их в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации, аккуратно мыть клетки три раза с пятью миллилитров стерильных PBS, удалить PBS, и добавить два миллилитров 0,25%Трипсин-ЭДТА.
Инкубировать клетки в течение четырех минут при комнатной температуре, а затем осторожно нажмите культуру блюдо для содействия отслоения клеток. Добавьте четыре миллилитров среды DMEM/F-12 для разгона клеток WNT5B sh4 и pLKO-GFP, перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугайте их на 300 xg в течение трех минут. Удалите супернатант и аккуратно повторно приостановите гранулы клетки в один миллилитр среды DMEM/F-12.
Подготовьте один миллилитр клеточной суспензии в концентрации три раза десять-пятый клетки на миллилитр и держать его на льду, чтобы предотвратить агрегацию клеток. Соедините полиэтиленовую трубку между розеткой устройства и шприц-насосом. Удалите носитель и добавьте один микролитер подготовленной клеточной подвески в вход устройства PDMS.
Затем загрузите подвеску ячейки в устройство с помощью шприц-насоса со скоростью потока 0,3 микролитера в минуту. Добавьте один микролитер среды DMEM/F-12 в вход устройства, затем загрузите носитель в устройство с помощью шприц-насоса. Загрузите 0,3 микролитров среды DMEM/F12 в устройство со шприц-насосом со скоростью потока 10 микролитров в минуту.
После загрузки клеток снимите трубку и запечатайте вход и розетку полиолефиновой лентой, чтобы создать закрытую культурную систему. Переместите устройство PDMS в 10-сантиметровую культурную тарелку и добавьте 10 миллилитров стерильных PBS вокруг устройства, чтобы избежать испарения среды. Перенесите культурное блюдо в инкубатор для тройной одноклеточной культуры.
Устройство PDMS имеет трехслойную структуру с местом захвата, которое подключается к культурной камере и каналу обхода. Разница в сопротивлении потока между камерой культуры и каналом обхода позволяет ячейке течь в положение захвата, что приводит к тому, что следующая ячейка проходит через bypass-канал к следующему месту захвата. Рефлюксный шаг используется для освобождения ячейки от места захвата и отправки ее в камеру культуры.
Эффективность захвата ячеев этого протокола оценивалась по трем различным типам ячеев. Человеческие лимфатические эндотелиальные клетки, или LECs, человеческие устные плоскоклеточные карциномы T2.6 клетки, выражающиеся WNT5B-специфические короткие шпильки РНК, и pLKO-GFP клетки управления вектором. Эффективность захвата одноклеточных трех продемонстрированых ячеек составила примерно 71% для LEC, 74% для клеток WNT5B sh4 и 78% для клеток pLKO-GFP.
Тройная эффективность одноклеточного захвата составила 48%Этот метод может быть использован для нескольких одноклеточных ко-культур лимфатических эндотелиальных клеток и плоскоклеточных раковых клеток, а пролиферацию клетки и морфологию можно наблюдать под микроскопом. Важно убедиться, что подготовленные подвески ячейки имеют минимальные агрегаты ячеей, потому что агрегаты ячееок не только снижают эффективность одного спаривания, но и могут засорять микроканалы. Взаимодействие клеток и клеток между отдельными клетками играет важную роль в контроле поведения клеток.
Наш метод может стать эффективным инструментом, который поможет исследователям изучить взаимодействие клеток и клеток на уровне одной клетки, что может привести к открытию новых механизмов, которые не могут быть легко получены из демографических исследований.
