È fondamentale combinare efficacemente l'efficienza di acquisizione con l'osservazione dinamica dell'immagine delle cellule vive per comprendere l'effetto dell'interazione cellula-cellula sui comportamenti delle cellule. Questo tubo può catturare in modo altamente efficiente più celle singole in una camera più grande e fornire una base di colture sufficiente, per il tracciamento dinamico di più comportamenti di interazione a cella singola. Iniziare preparando il dispositivo PDMS.
Mettere uno stampo wafer nella piastra di pesatura con 100 microlitri di triclorosilano in un essiccatore e applicare un vuoto per 15 minuti. Fermare il vuoto e salinizzare lo stampo del wafer nell'essiccatore a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Mescolare la base PDMS e l'agente di polimerizzazione PDMS con un rapporto di dieci a uno, quindi versare un totale di 20 grammi della miscela sullo stampo del wafer in un piatto di 15 centimetri.
Mettere il piatto di 15 centimetri in un essiccatore e applicare un vuoto per un minuto e mezzo. Quindi rimuovere il piatto dall'essiccatore ed eliminare le bolle d'aria residue nel PDMS con gas azoto. Curare il PDMS mettendo il piatto in forno a 65 gradi celsius per due o quattro ore.
Al termine, rimuovere la replica PDMS dallo stampo del wafer e perforare un ingresso di 1,5 millimetri e una presa di 0,5 millimetri sul PDMS. Pulire la replica PDMS e la superficie di scorrimento con nastro rimovibile. Trattare la superficie con plasma di ossigeno.
Quindi, allineare manualmente la replica PDMS con la diapositiva e metterli in contatto tra loro. Lasciare la diapositiva PDMS nel forno a 65 gradi Celsius per un giorno. Il giorno successivo, immergere il dispositivo PDMS in un contenitore pieno di PBS.
Posizionarlo nell'essiccatore e applicare il vuoto per 15 minuti. Spostare il dispositivo su un cappuccio di coltura cellulare e sterilizzarlo con luce UV per 30 minuti. Sostituire il buffer del dispositivo PDMS con il mezzo e incubarlo a quattro gradi Celsius per un giorno.
Quando le cellule raggiungono una confluenza dal 70 all'80%, rimuovere il mezzo di coltura e lavarle delicatamente tre volte con cinque millilitri di PBS. Aggiungere un millilitro di mezzo DMEM/F-12 contenente un colorante fluorescente micromolare alle celle WNT5B sh4 e pLKO-GFP e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con cinque millilitri di PBS sterile, rimuovere il PBS e aggiungere due millilitri dello 0,25% di tripside-EDTA.
Incubare le cellule per quattro minuti a temperatura ambiente, quindi toccare delicatamente il piatto di coltura per promuovere il distacco cellulare. Aggiungere quattro millilitri di mezzo DMEM/F-12 per disperdere le cellule WNT5B sh4 e pLKO-GFP, trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugarle a 300 xg per tre minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere delicatamente il pellet cellulare in un millilitro di mezzo DMEM/F-12.
Preparare un millilitro di sospensione cellulare a una concentrazione di tre per dieci-quinta cella per millilitro e tenerlo sul ghiaccio per evitare l'aggregazione cellulare. Collegare il tubo di politetrafluoroetilene tra l'uscita del dispositivo e la pompa della siringa. Rimuovere il supporto e aggiungere un microlitro della sospensione cellulare preparata nell'ingresso del dispositivo PDMS.
Quindi, caricare la sospensione cellulare nel dispositivo utilizzando una pompa per siringhe a una portata di 0,3 microlitri al minuto. Aggiungere un microlitro di mezzo DMEM/F-12 nell'ingresso del dispositivo, quindi caricare il mezzo nel dispositivo utilizzando una pompa per siringhe. Caricare 0,3 microlitri di mezzo DMEM/F12 nel dispositivo con la pompa della siringa a una portata di 10 microlitri al minuto.
Dopo aver caricato le celle, rimuovere il tubo e sigillare l'ingresso e l'uscita con nastro poliolefine per creare un sistema di coltura chiuso. Spostare il dispositivo PDMS su un piatto di coltura di 10 centimetri e aggiungere 10 millilitri di PBS sterile intorno al dispositivo per evitare l'evaporazione del mezzo. Trasferire il piatto di coltura in un incubatore per la tripla coltura uni-cella.
Il dispositivo PDMS ha una struttura a tre livelli con un sito di acquisizione che si collega alla camera di coltura e al canale di bypass. La differenza nella resistenza al flusso tra la camera di coltura e il canale di bypass consente alla cella di fluire nella posizione di acquisizione, il che fa sì che la cella seguente attraversa il canale di bypass fino al sito di acquisizione successivo. Il passo di reflusso viene utilizzato per rilasciare la cella dal sito di acquisizione e inviarla nella camera di coltura.
L'efficienza di acquisizione delle celle di questo protocollo è stata valutata su tre diversi tipi di celle. Cellule endoteliali linfatiche umane, o LEC, cellule del carcinoma a cellule squamose orali umane T2.6 che esprimono RNA a forcina corta specifico per WNT5B e cellule di controllo vettoriale pLKO-GFP. L'efficienza di acquisizione a cella singola delle tre celle dimostrate era di circa il 71% per i LED, del 74% per le celle sh4 WNT5B e del 78% per le celle pLKO-GFP.
La tripla efficienza di cattura a singola cellula è stata del 48%Questo metodo può essere utilizzato per più co-colture unicellari di cellule endoteliali linfatiche e cellule tumorali squamose, e la proliferazione e la morfologia della cellula possono essere osservate al microscopio. È importante assicurarsi che le sospensioni cellulari preparate abbiano aggregati cellulari minimi, perché gli aggregati cellulari non solo riducono l'efficienza di associazione singola, ma possono anche ostruire i micro canali. L'interazione cellula-cella tra le singole cellule svolge un ruolo importante nel controllo dei comportamenti delle cellule.
Il nostro metodo può fornire uno strumento efficace per aiutare i ricercatori a studiare l'interazione cellula-cellula a un singolo livello cellulare, il che può portare alla scoperta di nuovi meccanismi che non possono essere facilmente ottenuti da studi basati sulla popolazione.
