من الضروري الجمع بين فعالية فعالية التقاط الكفاءة مع دينامية مراقبة صورة الخلية الحية لفهم تأثير تفاعل الخلية الخلية على سلوك الخلية. هذا الأنبوب يمكن التقاط بكفاءة عالية متعددة خلايا واحدة في غرفة أكبر، وتوفير قاعدة الثقافات الكافية، لتتبع دينامية من عدة السلوكيات التفاعل خلية واحدة. ابدأ بإعداد جهاز PDMS.
ضع قالب رقاقة في طبق وزنها مع 100 ميكرولترات من ثلاثي الكلوروسلين في مجفف وتطبيق فراغ لمدة 15 دقيقة. وقف الفراغ وملوحة قالب رقاقة في مجفف في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. اخلطي قاعدة PDMS وعامل المعالجة PDMS بنسبة عشرة إلى واحد ، ثم صب ما مجموعه 20 جرامًا من الخليط على قالب الرقاقة في طبق طوله 15 سنتيمترًا.
ضع الطبق الذي يبلغ طوله 15 سنتيمترًا في مجففات وطبق فراغًا لمدة دقيقة ونصف. ثم إزالة الطبق من مجفف والقضاء على فقاعات الهواء المتبقية في PDMS مع غاز النيتروجين. علاج PDMS عن طريق وضع الطبق في فرن في 65 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات.
عند الانتهاء، إزالة النسخة المتماثلة PDMS من قالب رقاقة، ولكمة مدخل 1.5 ملليمتر و 0.5 ملليمتر منفذ على PDMS. قم بتنظيف النسخة المتماثلة PDMS و سطح الشريحة مع الشريط القابل للإزالة. علاج السطح مع البلازما الأكسجين.
ثم محاذاة النسخة المتماثلة PDMS مع الشريحة يدوياً وجعلها في اتصال مع بعضها البعض. اترك شريحة PDMS في الفرن 65 درجة مئوية ليوم واحد. في اليوم التالي، غمر جهاز PDMS في حاوية مليئة بـ PBS.
وضعه في مجفف، وتطبيق فراغ لمدة 15 دقيقة. نقل الجهاز إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية وتعقيمه مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. استبدل العازلة جهاز PDMS مع المتوسطة واحتضانه في أربع درجات مئوية ليوم واحد.
عندما تحقق الخلايا 70 إلى 80٪ التقاء، وإزالة المتوسطة الثقافة وغسلها بلطف ثلاث مرات مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف ملليلتر واحد من متوسط DMEM/F-12 يحتوي على صبغة فلورية صغيرة واحدة إلى خلايا WNT5B sh4 وpLKO-GFP، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، وغسل بلطف الخلايا ثلاث مرات مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة، وإزالة برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلتر اثنين من 0.25٪تريبسين-EDTA.
احتضان الخلايا لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم الاستفادة بلطف طبق الثقافة لتعزيز مفرزة الخلية. إضافة أربعة ملليلتر من DMEM / F-12 المتوسطة لتفريق WNT5B sh4 وخلايا PLKO-GFP، ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي لهم في 300 xg لمدة ثلاث دقائق. إزالة فائقة وبلطف إعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من متوسطة DMEM /F-12.
إعداد ملليلتر واحد من تعليق الخلية بتركيز من ثلاثة أضعاف عشر إلى خمس خلايا لكل ملليلتر والاحتفاظ بها على الجليد لمنع تجميع الخلايا. توصيل أنبوب البوليتيترافلورو ايثيلين بين منفذ الجهاز ومضخة الحقنة. إزالة المتوسطة، وإضافة ميكرولتر واحد من تعليق الخلية المعدة في مدخل جهاز PDMS.
بعد ذلك، قم بتحميل تعليق الخلية في الجهاز باستخدام مضخة حقنة بمعدل تدفق 0.3 ميكرولترات في الدقيقة. أضف ميكرولتر واحد من متوسط DMEM/F-12 في مدخل الجهاز، ثم قم بتحميل الوسيط في الجهاز باستخدام مضخة حقنة. تحميل 0.3 ميكرولترات من DMEM/F12 المتوسطة في الجهاز مع مضخة حقنة بمعدل تدفق 10 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة.
بعد تحميل الخلايا، وإزالة الأنبوب، وختم مدخل ومأخذ مع الشريط polyolefin لإنشاء نظام ثقافة مغلقة. نقل جهاز PDMS إلى طبق ثقافة 10 سنتيمترا وإضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة حول الجهاز لتجنب تبخر المتوسطة. نقل طبق الثقافة إلى حاضنة لثقافة خلية واحدة ثلاثية.
يحتوي جهاز PDMS على بنية ثلاثية الطبقات مع موقع التقاط يتصل بغرفة الثقافة وقناة الالتفاف. يسمح الاختلاف في مقاومة التدفق بين غرفة الثقافة وقناة الالتفافية الخلية بالتدفق إلى موضع الالتقاط، مما يؤدي إلى مرور الخلية التالية عبر قناة الالتفافية إلى موقع الالتقاط التالي. يتم استخدام خطوة الارتجاع لتحرير الخلية من موقع الالتقاط وإرسالها إلى غرفة الثقافة.
تم تقييم كفاءة التقاط الخلايا لهذا البروتوكول على ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا. الخلايا البطانية اللمفاوية البشرية، أو LECs، الإنسان سرطان الخلايا الحرشفية عن طريق الفم T2.6 الخلايا التي تعبر عن WNT5B محددة رنا دبوس الشعر القصير، وخلايا مكافحة ناقلات pLKO-GFP. وكانت كفاءة التقاط الخلية الواحدة للخلايا الثلاث المُثبتة حوالي 71٪ بالنسبة لـ LECs، و74٪ لخلايا WNT5B sh4، و78٪ لخلايا pLKO-GFP.
وكان ثلاثية خلية واحدة التقاط الكفاءة 48 ٪ يمكن استخدام هذه الطريقة لعدة خلية واحدة الثقافات المشتركة من الخلايا البطانية اللمفاوية والخلايا السرطانية الحرشفية ، ويمكن ملاحظة انتشار الخلية ومورفولوجيا تحت المجهر. من المهم التأكد من أن تعليق الخلايا المعدة لديها مجاميع الخلية الحد الأدنى، لأن مجاميع الخلية ليس فقط تقليل كفاءة الاقتران واحد، ولكن يمكن أيضا تسد القنوات الصغيرة. التفاعل بين الخلايا الخلوية بين الخلايا الفردية يلعب دوراً هاماً في التحكم في سلوكيات الخلية.
يمكن أن توفر طريقتنا أداة فعالة لمساعدة الباحثين على دراسة التفاعل بين الخلايا والخلية على مستوى خلية واحدة ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف آليات جديدة لا يمكن الحصول عليها بسهولة من الدراسات السكانية.
