É fundamental combinar efetivamente a eficiência de captura com a observação dinâmica da imagem celular ao vivo para entender o efeito da interação célula-célula nos comportamentos celulares. Este tubo pode capturar de forma altamente eficiente múltiplas células únicas em uma câmara maior, e fornecer uma base de culturas suficiente, para o rastreamento dinâmico de múltiplos comportamentos de interação unicelular. Comece preparando o dispositivo PDMS.
Coloque um molde de wafer no prato de pesagem com 100 microliters de triclorosilano em um dessecador e aplique um vácuo por 15 minutos. Pare o vácuo e salinize o molde de wafer no desiccator a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Misture a base PDMS e o agente de cura PDMS em uma proporção de dez para um, em seguida, despeje um total de 20 gramas da mistura sobre o molde de wafer em um prato de 15 centímetros.
Coloque o prato de 15 centímetros em um desiccador e aplique um vácuo por um minuto e meio. Em seguida, remova o prato do desiccador e elimine bolhas de ar residuais no PDMS com gás nitrogênio. Cure o PDMS colocando o prato em um forno a 65 graus celsius por duas a quatro horas.
Quando terminar, remova a réplica PDMS do molde do wafer e bata uma entrada de 1,5 milímetros e uma tomada de 0,5 milímetros no PDMS. Limpe a réplica PDMS e a superfície de slides com fita removível. Trate a superfície com plasma de oxigênio.
Em seguida, alinhe manualmente a réplica PDMS com o slide e leve-as a contato entre si. Deixe o PDMS deslizar no forno Celsius de 65 graus por um dia. No dia seguinte, mergulhe o dispositivo PDMS em um contêiner cheio de PBS.
Coloque-o no desiccador e aplique o vácuo por 15 minutos. Mova o dispositivo para um capô de cultura celular e esterilize-o com luz UV por 30 minutos. Substitua o tampão do dispositivo PDMS por médio e incuba-o a quatro graus Celsius por um dia.
Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, remova o meio de cultura e lave-as três vezes com cinco mililitros de PBS. Adicione um mililitro de meio DMEM/F-12 contendo um corante fluorescente micromolar às células WNT5B sh4 e pLKO-GFP, e incuba-as por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, lave suavemente as células três vezes com cinco mililitros de PBS estéreis, remova o PBS e adicione dois mililitros de 0,25% Trypsin-EDTA.
Incubar as células por quatro minutos à temperatura ambiente e, em seguida, toque suavemente no prato de cultura para promover o descolamento celular. Adicione quatro mililitros de média DMEM/F-12 para dispersar as células WNT5B sh4 e pLKO-GFP, transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrifuá-las a 300 xg por três minutos. Remova o supernatante e suspenda suavemente a pelota da célula em um mililitro do meio DMEM/F-12.
Prepare um mililitro de suspensão celular a uma concentração de três vezes dez a cinco células por mililitro e mantenha-o no gelo para evitar a agregação celular. Conecte o tubo de politetrafluoroetileno entre a saída do dispositivo e a bomba de seringa. Remova o meio e adicione um microliter da suspensão celular preparada na entrada do dispositivo PDMS.
Em seguida, carregue a suspensão da célula no dispositivo usando uma bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 0,3 microliters por minuto. Adicione um microliter de meio DMEM/F-12 na entrada do dispositivo e carregue o meio no dispositivo usando uma bomba de seringa. Carregue 0,3 microliters de meio DMEM/F12 no dispositivo com a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 10 microliters por minuto.
Depois que as células forem carregadas, remova o tubo e sele a entrada e a saída com fita poliolefina para criar um sistema de cultura fechado. Mova o dispositivo PDMS para um prato de cultura de 10 centímetros e adicione 10 mililitros de PBS estéreis ao redor do dispositivo para evitar a evaporação do meio. Transfira o prato de cultura para uma incubadora para a cultura tripla unicelular.
O dispositivo PDMS possui uma estrutura de três camadas com um local de captura que se conecta à câmara de cultura e ao canal de desvio. A diferença na resistência ao fluxo entre a câmara de cultura e o canal de desvio permite que a célula flua para a posição de captura, o que faz com que a célula seguinte passe pelo canal de desvio até o próximo local de captura. O passo de refluxo é usado para liberar a célula do local de captura e enviá-la para a câmara de cultura.
A eficiência de captura celular deste protocolo foi avaliada em três tipos diferentes de células. Células endoteliais linfáticas humanas, ou LECs, carcinoma escamoso oral humano T2.6 células expressando RNA de grampo curto específico WNT5B, e células de controle vetorial pLKO-GFP. As eficiências de captura unicelular das três células demonstradas foram de aproximadamente 71% para os LECs, 74% para células sh4 WNT5B e 78% para as células pLKO-GFP.
A eficiência de captura tripla unicelular foi de 48% Este método pode ser usado para múltiplas co-culturas unicelulares de células linfáticas e células cancerígenas escamosas, e a proliferação e morfologia da célula podem ser observadas sob um microscópio. É importante garantir que as suspensões celulares preparadas tenham agregados celulares mínimos, pois os agregados celulares não só reduzem a eficiência de pareamento único, mas também podem entupir os micro canais. A interação célula-célula entre células individuais desempenha um papel importante no controle dos comportamentos celulares.
Nosso método pode fornecer uma ferramenta eficiente para ajudar os pesquisadores a estudar a interação célula-célula em um único nível celular, o que pode levar à descoberta de novos mecanismos que não podem ser facilmente obtidos a partir de estudos de base populacional.
