O sistema organoide 3D é considerado mais fisiologicamente relevante do que os ensaios 2D, e pode fornecer informações valiosas sobre a biologia que de outra forma seria desafiadora para adquirir. Este é um sistema adaptável onde podemos testar manipulações farmacológicas e genéticas com menos tempo e um custo significativamente menor do que usar uma abordagem in vivo. O teste matricial é muito complicado de lidar, pois se solidifica quando atinge a temperatura ambiente.
Ele só pode ser desenhado através de uma pipeta quando é líquido e deve ser mantido no gelo. A integridade do anel é importante para manter. Se a estrutura for interrompida, isso pode afetar negativamente o crescimento organoide, e você pode facilmente perder material ao mudar a mídia.
Inicie este procedimento com a preparação de células epiteliais de próstata basal e luminal do rato, conforme descrito no protocolo de texto. Lave a pelota celular em 500 microliters de mídia organoide do rato, depois suspenda novamente a pelota a uma densidade celular de 1.000 células por microliter. Para preparar misturas mestras, misture células epiteliais suspensas em meio organoide de camundongos com gel de matriz para gerar uma mistura final que contém 25% de células em mídia e 75% de gel de matriz.
Dependendo da aplicação a jusante, as células basais são tipicamente banhadas a uma concentração de 100 a 2.000 células por 80 microliters, enquanto as células luminais são banhadas a uma concentração de 2.000 a 10.000 células por 80 microlitadores. Para cada mistura celular, adicione 80 microliters do gel de matriz por poço de uma placa de 24 poços. Pipeta uma gota na metade inferior da parede do poço, evitando o contato direto com o revestimento de polímoma.
Depois de adicionar o gel de matriz, gire a placa para permitir que a mistura de célula de gel de matriz forme um anel ao redor da borda do poço. Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora de 5%C02 de 5%, 5%C02, para cima por 10 minutos para permitir que o gel de matriz endureça parcialmente. Depois de incubar por 10 minutos, gire a placa de 24 poços de cabeça para baixo e incubar por mais 50 minutos para permitir que o gel de matriz endureça completamente.
Em seguida, adicione 350 microliters de mídia organoide de camundongos pré-aquecidos ao centro de cada poço. Depois de adicionar a mídia, devolva a placa de 24 poços para a incubadora. Para repor a mídia organoide do rato, incline a placa de 24 poços em um ângulo de 45 graus e remova suavemente a mídia existente do centro de cada poço usando uma pipeta P1000 enquanto evita o anel de gel de matriz.
Adicione 350 microliters de mídia organoide de camundongos pré-aquecidas como antes. Recomenda-se adicionar um volume maior de mídia aos organoides cultivados por mais de cinco dias para evitar o rápido esgotamento dos principais nutrientes e fatores de crescimento. Remova a mídia de cada um, bem como antes.
Para coletar organoides, exploda repetidamente o gel de matriz, pipetando um mililitro de mídia despasque pré-aquecida diretamente no anel de gel de matriz até que todo o anel seja desalojado. Transfira a mistura organoide de gel de matriz desalojada para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Após a digestão completa, conforme descrito no protocolo de texto, adicione soro fisiológico tamponado com fosfato à pelota organoide e suspenda-se suavemente.
Pelota os organoides por centrifugação a 800 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente, e remova o supernatante usando uma micro-pipeta. Suspenda as pelotas organoides em 100 microliters de tampão de proteína por 10 microliters de volume celular embalado. Filme para suspender de nova.
Agora, sonicar os organoides submergindo tubos em gelo molhado e aplicando suavemente a ponta do dismembrador sônico na parte externa do tubo de microcrédito. Sonicate por 40 segundos a 20 kilohertz antes de prosseguir para a mancha ocidental com protocolos estabelecidos. Para coletar organoides de próstata das placas de 24 poços, remova a mídia de cada um, bem como antes.
Digerir o gel de matriz incubando com 500 microliters de mídia contendo despase por 30 minutos em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de CO2. Colete suspensão organoide digerida em um tubo micro-centrífuga. Em seguida, pelota os organoides por centrifugação a 800 vezes G por três minutos em temperatura ambiente, e remova o sobrenatante.
Para realizar a coloração imunofluorescente de montagem total de organoides de próstata, adicione primeiro 500 microliters de 4% de paraformaldeído em PBS. Incubar os organoides por duas horas em temperatura ambiente com agitação suave. Depois de lavar a pelota como descrito no protocolo de texto, adicione um micrograma por mililitro de mancha DAPI na solução de bloqueio e incubar por duas horas à temperatura ambiente.
Proteja a amostra da luz durante a incubação deste passo em frente. Após a centrifugação dos organoides como antes, adicione o anticorpo primário na solução de bloqueio e incuba durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave. De pelotas novamente, e lave a pelota com um milímetro de PBS por 15 minutos com agitação suave.
Repita este procedimento de lavagem duas vezes. Em seguida, adicione anticorpos secundários na solução de bloqueio, e incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave. Após a incubação, pelota os organoides, e lave a pelota por mais duas vezes.
Adicione um mililitro de 30% de sacarose na PBS com 1%Triton X-100 aos organoides pelleted. Em seguida, incubar por duas horas em temperatura ambiente com agitação suave. Depois de pelotização dos organoides novamente, adicione um milímetro de 45% de sacarose em PBS com 1%Triton X-100, e agite suavemente por duas horas em temperatura ambiente.
Em seguida, repita o procedimento, exceto adicionar um mililitro de 60% de sacarose em PBS com 1%Triton X-100. Pelota os organoides por centrifugação a 800 vezes G por três minutos à temperatura ambiente, e remova 95% do supernatante. Observe a pelota sob luz UV para confirmar que ela não foi perdida durante a remoção do supernante.
A pelota fica mais solta à medida que a concentração de sacarose se torna maior. Transfira 10 para 20 microliters da suspensão restante para um deslizamento de cobertura câmara, e prossiga para microscopia confocal. Células basais e luminais formam organoides com morfologias distintas.
Enquanto a maioria dos organoides derivados de basal são semelhantes em tamanho após sete dias na cultura, organoides derivados de luminal apresentam heterogeneidade significativa. Além disso, a maioria dos organoides derivados de basais contêm lúmens cercados por epitélio multicamadas, enquanto organoides derivados de luminal variam em morfologia de oco com epitélio de camada única a sólido com cabos de várias camadas de células que não canalizam. A análise da mancha ocidental revelou que organoides basais e luminosos mantêm características associadas às células primárias basais e luminais.
Organoides derivados de basal expressam níveis mais elevados do marcador basal citokeratin 5, enquanto organoides derivados de luminal expressam níveis mais altos do marcador luminal citokeratin 8. Tanto marcadores basais quanto luminosos foram detectados em organoides basais e luminosos na população a granel, talvez sugestivos de diferenciação. Organoides derivados de basal contêm epitélio multicamadas, com camadas externas expressando altos níveis do marcador basal p63, e camadas internas com níveis não detectáveis.
As camadas externas também expressam níveis moderados do marcador luminal cytokeratin 8, e as camadas internas têm altos níveis. Enquanto todas as células em organoides derivados de uma camada única mancham positivamente para citokeratina 8, apenas células selecionadas continham p63 nuclear. Deve-se tomar cuidado ao manusear o gel de matriz para garantir que ele não endureça antes de emplacamento de células na cultura organoide.
Dapi usado para microscopia pode causar irritação na pele. A luz UV também pode ser prejudicial. Equipamentos de proteção individual adequados são essenciais.
Podemos coletar RNA de organoides para realizar sequenciamento de RNA, o que nos dirá sobre como os perfis de expressão genética mudam durante a formação organoide ou em resposta à manipulação. Esse modelo permitiu que o campo da próstata tivesse um ensaio ex vivo reprodutível para estudar aspectos fundamentais da biologia epitelial e identificar reguladores no desenvolvimento e diferenciação.
