מערכת האורגנואידים תלת מימדית נחשבת רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר מיסיונים הדו-מימדיים, והיא יכולה לספק מידע רב ערך על הביולוגיה שאחרת היה מאתגר לרכוש. זוהי מערכת הסתגלות שבה אנו יכולים לבדוק מניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות עם פחות זמן ועלות נמוכה משמעותית מאשר באמצעות גישה in vivo. משפט מטריקס הוא מאוד מסובך להתמודד, כפי שהוא מתגבש כאשר הוא מגיע לטמפרטורת החדר.
זה יכול להימשך רק דרך פיפטה כאשר הוא נוזלי ויש לשמור על קרח. שלמות הטבעת חשובה לשמירה. אם המבנה משובש, זה יכול להשפיע לרעה על צמיחת organoid, ואתה יכול בקלות לאבד חומר בעת שינוי מדיה.
התחל הליך זה עם הכנת תאי אפיתל הערמונית הבסיסית והלומינלית של העכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לשטוף את גלולת התא ב 500 microliters של מדיה organoid העכבר, ולאחר מכן להשעות מחדש את גלולה בצפיפות התא של 1, 000 תאים לכל microliter. להכנת תערובות אב, יש לערבב תאי אפיתל התלויים במדיה אורגנואידית של העכבר עם ג'ל מטריצה כדי ליצור תערובת סופית המכילה 25% תאים במדיה וג'ל מטריצה 75%.
בהתאם ליישום במורד הזרם, תאים בזלתיים מצופים בדרך כלל בריכוז של 100 עד 2, 000 תאים לכל 80 מיקרוליטרים, ואילו תאים זוהרים מצופים בריכוז של 2, 000 עד 10, 000 תאים לכל 80 מיקרוליטרים. לכל תערובת תאים, מוסיפים 80 מיקרוליטר של ג'ל המטריצה ל הבאר של צלחת של 24 בארות. פיפטה טיפה על החצי התחתון של הקיר של באר תוך הימנעות ממגע ישיר עם ציפוי פולי-hema.
לאחר הוספת ג'ל המטריצה, מערבלים את הצלחת כדי לאפשר לתערובת תאי ג'ל המטריצה ליצור טבעת סביב שפת הבאר. מניחים את צלחת 24 באר לתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% C02 אינקובטור בצד ימין למעלה במשך 10 דקות כדי לאפשר את ג'ל מטריצה להקשיח חלקית. לאחר הדגירה במשך 10 דקות, הופכים את הצלחת 24 באר במהופך דגירה במשך 50 דקות נוספות כדי לאפשר את ג'ל מטריצה להקשיח לחלוטין.
לאחר מכן, הוסיפו למרכז כל באר 350 מיקרוליטרים של מדיה אורגנואידית של עכבר מחומם מראש. לאחר הוספת התקשורת, להחזיר את צלחת 24 באר לאנקובטור. כדי לחדש את מלאי האורגנואידים של העכבר, הטה את הצלחת באורך 24 בארות בזווית של 45 מעלות, והסר בעדינות מדיה קיימת ממרכז כל באר באמצעות פיפטה P1000 תוך הימנעות טבעת ג'ל מטריצה.
הוסף 350 מיקרוליטרים של מדיה אורגנואידית עכבר מחומם מראש כמו קודם. מומלץ להוסיף נפח גדול יותר של מדיה אורגנואידים מתורבתים במשך יותר מחמישה ימים כדי למנוע דלדול מהיר של חומרים מזינים מרכזיים וגורמי גדילה. הסר את המדיה מכל אחד מהם גם קודם לכן.
כדי לאסוף אורגנואידים, הפיצוץ שוב ושוב את ג'ל המטריצה על ידי צינור מיליליטר אחד של מדיה מחממת מראש המכילה דיספס ישירות על טבעת ג'ל מטריצה עד הטבעת כולה הוא נקע. מעבירים את תערובת האורגנואידים של ג'ל המטריצה לצינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר עיכול מלא כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסף מלוחים במאגר פוספט לכדור האורגנואיד, והשהה מחדש על-ידי החלקה עדין.
גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant באמצעות מיקרו פיפטה. להשעות מחדש את כדורי organoid ב 100 microliters של מאגר תזה חלבון לכל 10 microliters של נפח התא ארוז. החלק כדי להשעות מחדש.
עכשיו, sonicate האורגנואידים על ידי שקוע צינורות בקרח רטוב בעדינות החלת הקצה של dismembrator הקולי אל החלק החיצוני של צינור מיקרו צנטריפוגה. סוניקאט למשך 40 שניות ב-20 קילוהרץ לפני שתמשיך לפסים מערביים עם פרוטוקולים מבוססים. כדי לאסוף אורגנואידים הערמונית מן הצלחות 24-well, להסיר את המדיה מכל גם לפני.
לעכל את ג'ל מטריצה על ידי דגירה עם 500 microliters של מדיה המכילה dispase במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור. לאסוף השעיה אורגנואידית מתעכלת בצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant.
כדי לבצע כתמים immunofluorescent כל הר של אורגנואידים הערמונית, תחילה להוסיף 500 microliters של 4% paraformaldehyde ב PBS. דגירה האורגנואידים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות. לאחר שטיפת גלולה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, להוסיף מיקרוגרם אחד למיליליטר של כתם DAPI בתסימת חסימה, ו דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
הגן על המדגם מפני אור במהלך הדגירה מצעד זה קדימה. לאחר צנטריפוגה של האורגנואידים כבעבר, מוסיפים נוגדן ראשוני בתסימת חסימה ומטמיגים בן לילה בארבע מעלות צלזיוס עם טלטול עדין. גלולה האורגנואידים שוב, ולשטוף את גלולה עם מיליטר אחד של PBS במשך 15 דקות עם רעידות עדינות.
חזור על הליך כביסה זה פעמיים. לאחר מכן מוסיפים נוגדן משני בתסימת החסימה, ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס עם טלטול עדין. לאחר הדגירה, גלולה האורגנואידים, ולשטוף את גלולה במשך פעמיים נוספות.
הוסיפו מיליליטר אחד של 30% סוכרוז ב-PBS עם 1%Triton X-100 לאורגנואידים המהודרים. ואז דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות. לאחר גלולות האורגנואידים שוב, להוסיף מילימטר אחד של 45% סוכרוז ב PBS עם 1% טריטון X-100, בעדינות לנער במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, חזור על ההליך, למעט להוסיף מיליליטר אחד של 60%סוכרוז ב- PBS עם 1%Triton X-100. גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר 95% של supernatant. שימו לב לכדור תחת אור UV כדי לאשר שהוא לא אבד במהלך הסרת העל-טבעי.
גלולה הופך רופף יותר כמו הריכוז של סוכרוז הופך גבוה יותר. העבר 10 עד 20 מיקרוליטרים של ההשעיה הנותרת לכיסוי תאי, והמשך למיקרוסקופיה קונפוקלית. תאים בזליים ולומינליים יוצרים אורגנואידים עם מורפולוגיות נפרדות.
בעוד שרוב האורגנואידים שמקורם בבזל דומים בגודלם לאחר שבעה ימים בתרבות, אורגנואידים שמקורם בלומינל מפגינים הטרוגניות משמעותית. יתר על כן, רוב האורגנואידים שמקורם בבזל מכילים לומן המוקף באפיתל רב שכבתי, בעוד שאיברנואידים שמקורם בלומינל נעים במורפולוגיה מבלולים עם אפיתל חד שכבתי להתבסס עם מיתרי תאים רב שכבתיים שאינם מתעלים. ניתוח כתם מערבי גילה כי אורגנואידים שמקורם בבזל ובלומינל שומרים על תכונות הקשורות לתאים ראשיים בזליים ולומינליים.
אורגנואידים שמקורם בבזל מבטאים רמות גבוהות יותר של ציטוקרטין סמן בסיס 5, ואילו אורגנואידים שמקורם בלומינל מבטאים רמות גבוהות יותר של ציטוקרטין סמן זוהר 8. הן סמנים בזליים והן סמנים זוהרים זוהו באורגנואידים הבסיסיים והלומינליים באוכלוסייה בתפזורת, אולי מרמזים על בידול. אורגנואידים שמקורם בבזל מכילים אפיתל רב שכבתי, עם שכבות חוץ המבטאת רמות גבוהות של סמן בסיס p63, ושכבות פנימיות עם רמות שאינן ניתנות לגילוי.
השכבות החיצוניות מבטאות גם רמות מתונות של ציטוקראטין סמן זוהר 8, ושכבות פנימיות יש רמות גבוהות. בעוד שכל התאים באורגנואידים חד-שכבתיים שמקורם באורגנואידים מוכתמים באופן חיובי עבור ציטוקראטין 8, רק תאים נבחרים הכילו p63 גרעיני. יש לנקוט בזהירות בעת טיפול בג'ל מטריצה כדי להבטיח שהוא לא יתקשה לפני ציפוי תאים לתרבות האורגנואידית.
DAPI המשמש למיקרוסקופיה עלול לגרום לגירוי בעור. אור UV יכול גם להזיק. ציוד מגן אישי הולם הוא חיוני.
אנחנו יכולים לאסוף RNA מאיברנואידים כדי לבצע רצף RNA, אשר יספר לנו על איך פרופילים ביטוי גנים לשנות במהלך היווצרות organoid או בתגובה מניפולציה. מודל זה אפשר לשדה הערמונית יש מהפך ex vivo כדי ללמוד היבטים בסיסיים של ביולוגיה אפיתל ולזהות רגולטורים בפיתוח ובידול.
