3Dオルガノイドシステムは、2Dアッセイよりも生理学的に関連性が高いと考えられており、そうでなければ取得するのが難しい生物学に関する貴重な情報を提供することができます。これは、in vivoアプローチを使用するよりも、より少ない時間と大幅に低コストで薬理学的および遺伝子操作をテストできる適応可能なシステムです。マトリックストライアルは、室温に達したときに固まるので、処理するのが非常に難しいです。
それは液体であり、氷の上に維持されなければならない場合にのみ、ピペットを通して描くことができます。リングの完全性は維持するために重要である。構造が破壊された場合、それはオルガノイドの成長に悪影響を及ぼし、メディアを変更するときに材料を簡単に失う可能性があります。
この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、マウスの基底細胞および発光前立腺上皮細胞の調製から始めます。マウスオルガノイド培地500マイクロリットルで細胞ペレットを洗浄し、その後、1マイクロリットル当たり1,000細胞の細胞密度でペレットを再懸濁します。マスターミックスを調製するには、マウスオルガノイド培地に懸濁した上皮細胞をマトリックスゲルと混合し、培地中の25%の細胞と75%マトリックスゲルを含む最終混合物を生成する。
下流の用途に応じて、基底細胞は通常、80マイクロリットル当たり100〜2,000個の細胞の濃度でメッキされ、一方、ルミナルセルは80マイクロリットル当たり2,000〜10,000細胞の濃度でメッキされます。各細胞混合物について、24ウェルプレートのウェルあたり80マイクロリットルのマトリックスゲルを加える。ポリヘマコーティングとの直接接触を避けながら、ウェルの壁の下半分に液滴をピペット。
マトリックスゲルを添加した後、プレートを旋回させてマトリックスゲル細胞混合物がウェルの縁の周りにリングを形成するようにする。24ウェルプレートを37°C、5%C02インキュベーター右側に10分間置き、マトリックスゲルを部分的に硬化させます。10分間インキュベートした後、24ウェルプレートを逆さまに反転させ、さらに50分間インキュベートしてマトリックスゲルを完全に硬化させます。
次に、各ウェルの中心にドロップワイズプリ温加マウスオルガノイド培地の350マイクロリットルを追加します。培地を添加した後、24ウェルプレートをインキュベーターに戻します。マウスオルガノイドメディアを補充するには、24ウェルプレートを45度の角度で傾け、マトリックスゲルリングを避けながらP1000ピペットを使用して、各ウェルの中心から既存のメディアを静かに取り除きます。
以前のように、事前に温めたマウスオルガノイド培地の350マイクロリットルを追加します。主要な栄養素や成長因子の急速な枯渇を防ぐために、5日以上培養されたオルガノイドに大量のメディアを追加することをお勧めします。以前と同様に、各メディアからメディアを削除します。
オルガノイドを収集するために、リング全体が外れるまで、予温されたジスパーゼ含有培地の1ミリリットルをマトリックスゲルリングに直接ピペット化してマトリックスゲルを繰り返し爆破する。外れたマトリックスゲルオルガノイド混合物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。テキストプロトコルに記載されているように完全な消化に続いて、オルガノイドペレットにリン酸緩衝生理食塩分を加え、穏やかにフリックして再中断する。
ペレットは、室温で5分間Gの800倍の遠心分離によりオルガノイドをペレット化し、マイクロピペットを用いて上清を除去した。オルガノイドペレットを、パックされた細胞体積の10マイクロリットルあたり100マイクロリットルのタンパク質リシスバッファーで再懸濁する。フリックして再中断します。
今、湿った氷にチューブを水没させ、穏やかにマイクロ遠心チューブの外側にソニックディスメンブラターの先端を適用することによってオルガノイドを超音波処理します。確立されたプロトコルでウェスタンブロッティングに進む前に、20キロヘルツで40秒間超音波処理します。24ウェルプレートから前立腺オルガノイドを採取するには、前と同様に各々から培地を取り除きます。
500マイクロリットルのジスパーゼ含有培地を30分間摂氏37度、5%CO2インキュベーターでインキュベートしてマトリックスゲルを消化します。微細遠心分離管に消化されたオルガノイド懸濁液を収集します。次いで、室温で3分間Gの800倍の遠心分離によりオルガノイドをペレット化し、上清を除去した。
前立腺オルガノイドの全実装免疫蛍光染色を行うために、まずPBSに4%パラホルムアルデヒドの500マイクロリットルを加える。オルガノイドを穏やかな揺れで室温で2時間インキュベートします。テキストプロトコルに記載されているようにペレットを洗浄した後、ブロッキング溶液中のDAPI染色の1ミリリットル当たり1マイクログラムを加え、室温で2時間インキュベートする。
このステップの前進からインキュベーション中に光からサンプルを保護します。以前のようにオルガノイドの遠心分離に続いて、ブロッキング溶液に一次抗体を加え、穏やかな揺れで摂氏4度で一晩インキュベートする。オルガノイドを再びペレットにし、PBSの1ミリターで1ミリターで15分間穏やかな揺れをして洗浄します。
この洗浄手順を2回繰り返します。次いで、ブロッキング溶液に二次抗体を加え、穏やかな揺れで摂氏4度で一晩インキュベートする。インキュベーションに続いて、ペレットをオルガノイドに、ペレットをさらに2回洗浄する。
ペレット化オルガノイドに1%トリトンX-100でPBSに30%スクロースの1ミリリットルを加えます。その後、穏やかな揺れで室温で2時間インキュベートします。オルガノイドを再びペレット化した後、PBSに1%トリトンX-100で45%スクロースの1ミリメートルを加え、室温で2時間軽く振ります。
次に、1%トリトンX-100でPBSに60%スクロースの1ミリリットルを加える以外の手順を繰り返す。ペレットは、室温で3分間Gの800倍の遠心分離によりオルガノイドをペレット化し、上清の95%を除去した。紫外線下のペレットを観察して、上清の除去中に失われないことを確認します。
スクロースの濃度が高くなるほどペレットが緩くなります。残りの懸濁液の10~20マイクロリットルをチャンバーカバースリップに移し、共焦点顕微鏡に進みます。基底細胞と光細胞は、異なる形態を有するオルガノイドを形成する。
ほとんどの基底由来オルガノイドは培養7日後の大きさが似ていますが、ルミナル由来のオルガノイドは有意な不均一性を示します。さらに、ほとんどの基底由来オルガノイドは多層上皮に囲まれた内腔を含み、一方、単層上皮を有する中空から、カナル化しない細胞の多層コードを有する固体まで、形態に及ぶ。ウェスタンブロット分析は、基底および発光由来のオルガノイドが基底および発光原発細胞に関連する特徴を保持することを明らかにした。
基底由来オルガノイドは、基底マーカーサイトケラチン5のより高いレベルを発現し、一方、ルミナル由来オルガノイドは、より高いレベルの発光マーカーサイトケラチンを発現する。基底マーカーと発光マーカーの両方が、おそらく分化を示唆するバルク集団の基底および発光由来オルガノイドで検出された。基底由来オルガノイドは多層上皮を含み、外側の層は高レベルの基底マーカーp63を発現し、内層は検出不能なレベルを有する。
外層はまた、中程度のレベルの発光マーカーサイトケラチン8を発現し、内層は高レベルを有する。単層のルミナル由来オルガノイド中のすべての細胞はサイトケラチン8に対して陽性染色するが、核p63を含む細胞の選択のみが含まれる。マトリックスゲルを取り扱う際には、細胞をオルガノイド培養に入れる前に固まらないように注意する必要があります。
顕微鏡検査に使用されるDAPIは、皮膚刺激を引き起こす可能性があります。UV光も有害である可能性があります。適切な個人用保護具が不可欠です。
オルガノイドからRNAを収集してRNAシーケンシングを行い、オルガノイドの形成中や操作に応答して遺伝子発現プロファイルがどのように変化するかを教えてくれます。このモデルは前立腺の分野が上皮生物学の基本的な側面を研究し、発達および分化の調節因子を特定するために再生可能なex vivoのアッセイを持つことを可能にした。
