Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı hibe tarafından desteklenen oldu.

1. 1. Gün Başlamadan önce: Sinek sağlıklı bir nüfus standart kültür protokolleri kullanarak muhafaza edilmelidir: yumurta yatıyordu ve geliştirme 3. instar larvaları pupariation başlatmak dolaşıp kadar sabit bir sıcaklıkta devam etmek için izin 3-4 gün sonra, şişe veya şişeleri yetişkin kaldırmak . Larva / pupa geçiş prepupae (0 saat sonra kabul puparium oluşumu-APF) oluşumu ile işaretlenir. TAŞINMAZ pupa beyaz renklenme büyük pupa ve larvalar, henüz dikdörtgen, yuvarlak şekilli ve ön spiracles çıkıntısı pupariation başlamamış ayırt edilirler. Şunlara ihtiyacınız olacak: <ul><li> Pupa toplamak için bir boya fırçası </li><li> Kültür pupa için nemli odasına: Petri kabı ıslatılmış kağıt havlu ile kaplı ve pupa toplanması, genotip ya da cinsel çeşitli noktalarında işaretlenmiş filtre kağıdı ile kaplı </li><li> 1X Fosfat pupa yıkamak için tamponlu salin (PBS) </li></ul> Koleksiyon, kültür ve evreleme pupa <ol><li> Islak bir fırça kullanarak 0hr APF pupa kültürü şişeleri / flakon yavaşça kaldırın ve nemli haznesinin kapağı koyun. </li><li> Fırça ve 1X PBS kullanarak pupa pupa halinde enkaz kaldırmak için hafifçe yıkayın </li><li> Eğer gerekli sıralama, cinsiyete göre pupa. Pupa gonad primordia cinsiyetler sıralamak için kullanılabilir. Erkek gonad primordia saydam diskler, yaklaşık 2 / 3 5 vücut uzunluğu aşağı pupa manikür yoluyla kolayca görülen bir yan çifti . Kadın gonad primordia küçük ve kolayca tespit edilmemiştir. </li><li> Pupa nemli odasında uygun etiketli pozisyonda yerleştirin ve sabit sıcaklıkta dönmek. Kültür uygun gelişimsel bir zaman noktasında. </li></ol> 2. 2. Gün: Diseksiyon, fiksasyon ve primer antikor inkübasyon Başlamadan önce: Şunlara ihtiyacınız olacak: <ul><li> Diseksiyon stereomikroskopta </li><li> Cerrahi forseps </li><li> Cerrahi neşter sayısı 11 bıçaklar </li><li> İki dokuz iyi cam depresyon yemekleri (Corning ürün # 7220-85) <ul><li> 1X PBS ile bir çanak kuyu doldurun: Bu disseke pupa temizlik için durulama çanak </li><li> Fiksasyon tamponu ile ikinci çanağı kuyu doldurun </li></ul></li><li> Antikor inkübasyon için Nemli odası. Biz, ıslatılmış kağıt havlu ile kaplı plastik yapışmalı, sandviç kutuları kullanın. </li><li> Fiksasyon tampon: 1x PBS,% 4 paraformaldehid,% 0.2 deoxycholic asit (permeabilization için) </li><li> Diseksiyon platformu: Clear mikroskop lamı, bir tarafında çift taraflı bant yapıştırılır bir parça ile </li><li> 1X PBS </li><li> P100 veya P200 pipet </li></ul> Diseksiyon <ol><li> Forseps kullanarak hafifçe pupa tek bir seferde kaldırmak ve geniş bant genişliği karşı karşıya pupa ön ucu ile diseksiyon platformu üzerine koyun. Pupa aşırı ıslak ise, ilk, kağıt havlu ile kurulayın kurulayın. </li><li> Pupa tamamen bant yapıştırılır önce, yerleştirmek için bir fırça kullanın. </li><li> İzin hava kuru pupa ve bant (5-10 dakika) bağlı </li><li> Bilateral cerrahi bistüri ile her pupa teşrih. Bu en iyi ön pupa arka sonuna kadar tek bir hızlı kesim gerçekleştirilir. Eğer doğru yapılırsa, kesme, ön ve arka spiracles çiftleri iki eşit parçaya böler. Yıkama ve hızlı bir şekilde, doku proteolitik hasarı önlemek için gerekli örnekleri temizliği gibi bir seferde en fazla 10 pupa parçalara ayır. </li><li> Bir fırça kullanarak, bant gevşetin her disseke pupa 1X PBS küçük bir miktar transfer. </li></ol> Temizleme, fiksasyon ve primer antikor inkübasyon <ol start="6"><li> Bir çift cerrahi forseps anteriora bireysel bir pupa yarım kavramak ve hemen durulama çanak iyi batırmayın ile. Diseksiyonu platformu mikroskop sahnede durulama çanak tarafından değiştirilmesi gerekir. Işlemleri tamamlandıktan ve örnekleri montaj için hazır olana kadar pupa halinde numune bırakılmalıdır. </li><li> Hala açgözlü iken pupa yarısı karın iç doku hafifçe yıkamak için bir pipet kullanın. Yıkama sırasında çok fazla baskı epitel hücrelerinin kaybına yol açabilir. </li><li> Hemen oda sıcaklığında temiz pupa yarım fiksasyonu tampon transferi ve kalan pupa yarıya benzer bir süreç. 20 pupa yarısının uygulama, teşrih ve yıkama 5 dakikadan daha az almalıdır. </li><li> Pupa fiksasyonu tampon 1 (bir) saat oda sıcaklığında inkübe izin verin. </li><li> 1X PBS sabit pupa 3x beş dakika durulayın </li><li> Örnekleri immünohistokimya için hemen işlenmiş olabilir veya hücreleri veya epitopu reaktivite kaybı olmadan 3 aya kadar, -20 ° C&#39;de% 100 etanol saklanabilir. </li><li> Örnekleri saklamak için, bir seyreltme yoluyla örnekleri dengelenmesiPBS serisi:% 100 EtOH transfer öncesinde her seyreltme 20 dakika oda sıcaklığında EtOH (3:1, 1:1, 1:3). </li><li> Örnekleri immünohistokimya için işleme önce ters dizi PBS yeniden dengelenmiş olmalıdır. </li><li> 1x PBS (2% sığır serum albümini ile desteklenmiş) 1 (bir) saat primer antikor ek önce örnekleri Blok. </li><li> 4 gece boyunca uygun konsantrasyonu 1X PBS içinde seyreltilir primer antikor ° C sallanan olmadan inkübe edin. </li></ol> 3. 3. Gün: Sekonder antikor inkübasyon, montaj ve görüntüleme Başlamadan önce: Şunlara ihtiyacınız olacak: <ul><li> İki cerrahi forseps </li><li> Montaj medya (gliserol, Vectashield [Vektör Labs], ya da Slowfade Altın [Invitrogen]) </li><li> Depresyon iyi mikroskop lamı (0.8 mm) </li><li> Lamelleri (24 x 40 mm) </li></ul> İkincil antikor kuluçka ve montaj: <ol><li> Örnekleri 3x 1x PBS ile 10 dakika yıkayın </li><li> Ikincil antikor ek önce 1x PBS (2% sığır serum albümini ile desteklenmiş) 1 (bir) saat örnekleri Blok. </li><li> 1X PBS uygun konsantrasyon olmadan karanlıkta, oda sıcaklığında 3 (üç) saat sallanan seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. </li><li> Örnekleri 3x 1x PBS ile 10 dakika yıkayın </li><li> Eğer uygunsa, counterstain pupa (Örnek DAPI ile çekirdekleri leke [4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole] 10 dakika PBS içinde seyreltilmesi). </li><li> Montajdan önce uygun ortam örnekleri (en az 30 dakika) dengelenmesi. </li><li> Bir örnek slayt hazırlayın. Pupa morfolojisi düz montaj önler. Örnekleri iyi görüntüleme için bir depresyon slayt (damla slayt) monte edilir. Place de depresyon montaj medya 75-100ul. Çeşitli örnekler tek bir slayt monte edilebilir. </li><li> Pupa halinde montaj edilmeden önce numuneleri uzaklaştırılmalıdır. Anteriora iç pupa membran kavramak için emin bir birey pupa halinde tutun. </li><li> Ikinci bir çift forseps ile yavaşça başkanı tarafından iç pupa membran kavramak ve pupa halinde çıkarın. </li><li> Hemen depresyon örnek aktarmak ve ek örnekler işleme devam edin. </li><li> Lateral yüzeyi yukarı bakacak şekilde depresyon iyi örnekleri düzgün bir prob veya forseps pozisyonu kullanarak. Ara sıra hava kabarcığı, bir sonda ile kaldırılabilir. </li><li> Yavaşça hava kabarcıklarının tanıtmak için özen örnekleri üzerine lamel düşük </li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: Örnekler bu protokolü yetişkin karın brüt morfoloji korumak kullanılarak hazırlanmıştır. Resim yığınlarının karın topoloji araştırmak için uygulanabilir bir iki boyutlu görüntü ve 3 boyutlu render oluşturmak için tahmin edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Drosophila pupa Segmentasyondaki gen ürünleri kanatsız protein ve Engrailed ifade (En-gal4: UAS-GFP) ve anti-GFP fare anti-Wg (Iowa Hibridoma Bankası 4D4) ile 26 saat sonra (APF) puparium oluşumu görüntülendi. 10x büyütme, ön sol ve dorsal kadar. Nucleii DAPI ile zıt. Yaklaşık 50 görüntü (2.5μm dilimleri arasında ΔZ) yığınlar tahmin edildi.

<ol>
	<li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila.">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Matsuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Morphology+and+evolution+of+the+insect+abdomen.">in Morphology and evolution of the insect abdomen.</a> , (1976).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster.">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu video sunulan teknikler gelişimsel zaman noktalarında çeşitli Drosophila pupa hazırlamak için kullanılabilir. 32 saat 24 saat süre APF sırasında işlenmiş pupa APF epitel hücre kaybını en yatkındır. Genişletilmiş İnkübasyon sırasında deterjan kullanımı (örneğin, Triton X-100 ve Tween-20 gibi) hücre kaybı olasılığını artırır ve bu nedenle tavsiye edilmez. Aksine, deoxycholic asit, ilk fiksasyonu adımı sırasında bir deterjan olarak kullanılır. Tüm sonraki basamaklar deterjan olmadan 1X PBS yapılmaktadır. Ayrıca, uzun İnkübasyon sırasında örnekleri sallanan hücre kaybını artırır ve kaçınılmalıdır. Örnekleri konfokal mikroskopi teknikleri kullanarak görüntülü olabilir. Ancak, Drosophila pupa da anlatıldığı gibi işlenmiş konfokal teknikleri ile kıyaslanabilir görüntü kalitesi veren yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskopi sistemi kullanarak görüntülü olabilir.

<ul><li> Diseksiyon stereomikroskopta </li><li> Cerrahi forseps </li><li> Cerrahi neşter sayısı 11 bıçaklar </li><li> Dokuz iyi cam depresyon yemekleri (Corning ürün # 7220-85) </li><li> Nemli odasına kültür pupa </li><li> 1X fosfat tamponlu salin (PBS) </li><li> # 11 cerrahi neşter </li><li> çift ​​taraflı bant </li><li> Fiksasyon tampon: 1x PBS,% 4 paraformaldehid,% 0.2 deoxycholic asit (permeabilization için) </li><li> P100 veya P200 pipet </li><li> Depresyon iyi mikroskop lamı (0.8 mm) </li></ul>

drosophila pupal abdomen immunohistochemistry

Drosophila pupa karın epitel morfolojilerinden çalışma ve cinsel dimorfik 1-3 morfolojileri gelişimi için kurulmuş bir model sistem. (25 ° C) yaklaşık 96 saat boyunca pupa devresi sırasında, hayali hücreleri prolifere popülasyonlar erişkin karın segmentleri üretmek için larva epidermisi değiştirin. Bu hayali hücreleri, embriyogenez sırasında doğan, larvaların her karın segment histoblast yuva yan çift olarak var. Histoblast yuva dört çift yetişkin dorsal kütikül (anterior ve posterior dorsal yuvalar), ventral kütikül (ventral yuvalar) ve her segmentin (hava deliği yuvalar) 4 ile ilişkili spiracles neden olmaktadır. Puparation üzerine, bu diploid hücrelerinde (büyük polyploid larva epidermal hücreler-LECs boyutuna göre ayırt) proliferasyon, göç ve LECs değiştirilmesi basmakalıp bir süreç başlar. Çeşitli moleküler ve genetik araçları yetişkin karın morfonogenezi yer alan genetik yollarının katkıları araştırmak için istihdam edilebilirler. Ultimate yetişkin fenotiplerinin genellikle yetişkin karın tırnak etlerini aşağıdaki diseksiyon analiz edilmektedir. Ancak, altta yatan moleküler süreçlerin incelenmesi benzersiz zorluklar pupa epitel immünohistokimyasal analizleri, gerektirir. Geçici olarak iki ayrı epitel nüfus (larva ve hayali), dinamik morfolojilerinden ve etkileşimleri, diseksiyon ve daha sonraki işleme sırasında aşırı hücre kaybı eğilimli kırılgan bir doku oluşturur. Diseksiyon, sabitleme, montaj ve tutarlı yüksek kaliteli örnekleri konfokal veya standart floresan mikroskopi için uygun oluşturmak immunohistokimyasal çalışmalar için Drosophila pupa abdominem epitel görüntüleme yöntemleri geliştirmişlerdir.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry at JoVE.com

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antikor boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa yetişkin karın gelişim genetiği genetik analizler artırabilirsiniz. Biz sahneye diseksiyon, fiksasyon ve antikor boyama için protokol mevcut<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa karın.

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

16.2K Görüntüleme.  University of Alabama. Antikor boyama Drosophila Pupa yetişkin karın gelişim genetiği genetik analizler artırabilirsiniz. Biz sahneye diseksiyon, fiksasyon ve antikor boyama için protokol mevcut Drosophila Pupa karın.

Video: Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Dilim İmmünohistokimya için hazırlıklar İnce Kesit

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Biyoloji

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ hybridizations, a mainstay of developmental biology, are useful to study the spatial and temporal patterns of gene expression in developing tissues at the level of transcription. If antibodies that target the protein products of gene transcription have not yet been developed, and/or there are multiple gene copies of a particular protein in the genome that cannot be differentiated using available antibodies, in situs can be used instead. While an in situ technique for larval wing discs has been available to the butterfly community for several years, the current protocol has been optimized for the larger and more fragile pupal wings.

In order to examine gene expression in the pupal wing tissue of Bicyclus anynana, we present an optimized protocol for in situ hybridizations using riboprobes. We also provide guidelines for the further optimization of this protocol for use in pupal wings of other Lepidopteran species.

Riboprobes kullanarak Kelebek pupa Wings in situ Protokolü

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

İmmünohistokimya: Parafin Bölüm Vektör Labs Vectastain ABC Seti

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

İnsan Protein Atlas içinde Doku Mikroarray&#39;ler, İmmünohistokimya Boyama ve Sayısallaştırma Üretimi

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Diseksiyon ve montajı<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz Diskler

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Methods Article

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya