Bu protokol, farklı kültürleri görmeyi ve hücre dışı matrisle etkileşimlerini gözlemleyene neden olur. Bu yöntemin en büyük avantajı, elde ettiğiniz matrisin fibroblast tarafından yeniolması ve in vivo olarak üretilenlere oldukça benzer olmasıdır. Biz bu hastalık pişirme yemekleri elde fibroblast kullanırken alakasız olduğuna inanıyoruz.
Bu hücrelerden bir matris oluşturmak bizi nasıl etkileyebileceği konusunda aydınlatabilir, örneğin, kalıcı durum. Bu yöntemler, örneğin, matris mülkiyetlerinden kurtulanlara fiziksel çalışmalar da uygulanabilir. Bu protokolün görselleştirilmesi, naip lik basamakların pipetleme tekniğini gözlemlemek önemlidir.
Bu yöntemleri ilk kez denerken muhtemelen beklenenden daha fazla zaman alacaktır. Tavsiyemiz, bir sonraki adımlara hazırlanmak için sürelerini kullanarak mümkün olduğunca çok şey hazırlamanızdır. El yazması talimatlara göre %0,2 jelatin, %1 glutaraldehit ve bir molar etanolin çözeltisi hazırlayarak başlayın.
Her çözümü kullanmadan önce 0,22 mikrometre filtreden çalıştırdığından emin olun. Sonra, askorbik asit ve lysis tampon hazırlayın. PBS kalem strepini el yazmasında açıklandığı gibi seyreltin ve DMEM'i %10 FBS ile hazırlayın.
100 mililitre steril suya 2 gram BSA ekleyerek ve kaynar su banyosunda yedi dakika ısıtarak ısıden arındırılmış %2 BSA hazırlayın. Sonra, penisilin ile ek FBS, streptomisin, gentamisin, ve amphotericin B.Kültür rekombinant telomerler ölümsüzleştirilmiş insan sünnet derisi fibroblastlar ve DMEM ile transfeced 10%FBS ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit onları muhafaza. Birincil fibroblast kültürünü oluşturmak için, yaklaşık 2-3 mililitre küp küçük parçalar halinde doku örnekleri kesilmiş ve antibiyotik yüksek konsantrasyonile FPS onları tohum.
İlk fibroblastlar ortaya çıktığında, hücre bakımı için ortamı FBM ortamı ile değiştirin. Altı kuyulu bir plakanın her kuyusuna %0,2 jelatin çözeltisinin iki mililitresini ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derece veya bir gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra jelatini aspire edin ve her birini iki mililitre PBS ile yıkayın.
Her kuyuya glutaraldehit% 1 iki mililitre ekleyin ve jelatin çapraz bağlantı olacak otuz dakika boyunca oda sıcaklığında plaka kuluçka. Glutaraldehit aspire ve beş dakika pbs iki mililitre kuyuyıkama. Kalan glutaraldehit engellemek için, bir molar etanolin iki mililitre ekleyin ve otuz dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka.
Etanolamin aspire ve PBS ile yıkıntıları tekrarlayın. %10 FPS ile bir mililitre DMEM ekleyin. Ortam hemen pembeye dönerse, çıkarın, kuyuları iki mililitre PBS ile bir kez yıkayın ve bir mililitre DMEM ekleyin.
Tohum fibroblast süspansiyon bir mililitre ile 5 x 10 her kuyuda beşinci hücrelere ve kültür hücreleri kadar 100% kesişme ulaşılır. Daha sonra orta çıkarın ve mililitre askorbik asit başına% 10 FBS ve 50 mikrogram ile DMEM ile değiştirin. Altı gün boyunca her iki günde bir orta değiştirin.
Son askorbik asit tedavisinden iki gün sonra orta yıkayın ve pbs iki mililitre ile kuyuları yıkayın. YıkTılar sonra, yavaş yavaş önceden ısıtılmış lysis tampon bir mililitre ekleyin ve fibroblastlar lysed kadar beş ila on dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka. Lysis tamponu çıkarmadan, her kuyuya iki mililitre PBS ekleyin ve yaklaşık 2,5 mililitre aspire edin.
Toplam üç yıkıntı için bu işlemi iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, kalem-strep ile PBS iki mililitre ekleyin. Plakayı filmle kapatın ve dört santigrat derecede üç aya kadar saklayın.
Maksimum bir araya kadar% 2 FBS ile HUVEC hücreleri ve EMB-2 büyümek. Daha sonra orta yı sekiz saat boyunca FBS olmadan EBM-2 ile değiştirin. Hücre tohumlama için matris hazırlamak için, buzdolabından çıkarın ve bir saat oda sıcaklığında bırakın.
Isı denatüre iki mililitre ekleyerek matrisblok 2%BSA ve bir saat boyunca 37 santigrat derece onları kuluçka. Sonra, BSA aspire ve PBS iki mililitre ile yıkayın. Tohum 2 x 10 beşinci HUVEC hücreleri için plaka fibroblast kaynaklı matrisler ile kaplı her kuyuya.
Hücreleri 37 derecede 16 saat kuluçkaya yatırın ve 20-40x büyütmede standart parlak alan mikroskobu altında tüp benzeri yapıları inceleyin. Bu protokol, PDGF tedavisinin fibroblast türetilmiş matris oluşumu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır. PDGF ile inkübe edilen BGH üçüncü fibroblastları, phgf olmadan kuluçkaya yatanlara göre matrislerde daha uyumlu bir hücre dağılımı gösterdi.
PDGF uyarılmış fibroblastlardan elde edilen matrislerde kollajen 1 ve fibronektin protein ekspresyonu artmış ve dolayısıyla matris kalınlığı artırıldı. Ayrıca yönlülük histogramları kollajen 1 ve fibronektinin paralel desenler gösterdiğini göstermektedir. HUVEC hücreleri PDGF tarafından uyarılmış fibroblastlardan elde edilen hücredışı matrislere tohumlandığında, uyarılan koşullardan daha fazla kılcal damar benzeri yapılar geliştirdiler.
PDGF-BB uyarılmış fibroblastlardan elde edilen matrislerin endotel hücrelerinin aktivasyonunu desteklediğini doğrular. Bu yordamı gerçekleştirirken, önceden çözümler hazırlamak ve başlamadan önce hücrelerin hazır olduğundan emin olmak önemlidir. Endotel hücrelerinin yanı sıra çalışmalar da epitel hücreleri ile tohumlanmış olabilir ve medya veya sitotoksik ilaçlar da durum gibi dış faktörlere tepki görülebilir.
Ekstra-hücresel matris üretimi tümör makroçevre deneylerin tasarımında çok önemlidir.
