Este protocolo permite ver diferentes tipos de culturas e observar suas interações com matriz extracelular. A principal vantagem deste método é que a matriz que você obtém é regenerada pelo fibroblasto e será bastante semelhante às geradas in vivo. Acreditamos que essa doença é irrelevante ao usar fibroblasto de pratos de cozimento.
Estabelecer uma matriz a partir dessas células poderia nos esclarecer como ela pode afetar, por exemplo, a situação persistente. Esses métodos também podem ser aplicados, por exemplo, a estudos físicos a sobreviventes de matrizes. Visualização deste protocolo é importante observar uma técnica de pipetação dos passos que você tem que regente.
Ao experimentar esses métodos pela primeira vez, provavelmente levará mais tempo do que o esperado. Nosso conselho é preparar o máximo que puder com antecedência e usando períodos de duração para se preparar para os próximos passos. Comece preparando 0,2% de gelatina, 1%glutaraldeído e uma solução de etanolamina molar de acordo com as instruções do manuscrito.
Certifique-se de executar cada solução através de um filtro de 0,22 micrômetro antes de ser usado. Em seguida, prepare o ácido ascórbico e o tampão de lise. Diluir a caneta-estreptococos pbs como descrito no manuscrito e preparar OMEM com 10%FBS.
Prepare o calor desnaturado 2%BSA adicionando 2 gramas de BSA a 100 mililitros de água estéril e aquecendo-a em um banho de água fervente por sete minutos. Em seguida, suplementar FBS com penicilina, estreptomicina, gentamicina e anfotericina B.Telômeros recombinantes transfectaram fibroblastos humanos de prepúcios imortais e DMEM com 10% de FBS e os mantiveram a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para estabelecer a cultura do fibroblasto primário, corte as amostras de tecido em pequenos pedaços de aproximadamente dois a três mililitros cubos e semeados em FPS com uma alta concentração de antibióticos.
Quando os primeiros fibroblastos aparecerem, substitua o meio por meio FBM para manutenção celular. Adicione dois mililitros de solução de gelatina de 0,2% a cada poço de uma placa de seis poços e incuba-o por uma hora para 37 graus Celsius ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, aspire a gelatina e lave cada poço com dois mililitros de PBS.
Adicione dois mililitros de 1% de glutaraldeído a cada poço e incubar a placa em temperatura ambiente por trinta minutos que cruzará a gelatina. Aspire o glutaraldeído e lave os poços em dois mililitros de PBS por cinco minutos. Para bloquear o glutaraldeído restante, adicione dois mililitros de uma etanolamina molar e incubar a placa em temperatura ambiente por trinta minutos.
Aspire a etanolamina e repita as lavagens com PBS. Adicione um mililitro de DMEM com 10%FPS. Se o meio ficar rosa imediatamente, remova-o, lave os poços uma vez com dois mililitros de PBS e adicione outro mililitro de DMEM.
Semente um mililitro de suspensão do fibroblasto com 5 x 10 para as quintas células em cada poço e cultura as células até 100% de confluência é alcançada. Em seguida, remova o meio e substitua-o por DMEM por 10% FBS e 50 microgramas por ácido ascórbico mililitro. Substitua o meio a cada dois dias por seis dias.
Dois dias após o último tratamento com ácido ascórbico, remova o meio e lave os poços com dois mililitros de PBS. Após as lavagens, adicione lentamente um mililitro de tampão de lise pré-aquecido e incubar a placa em temperatura ambiente por cinco a dez minutos até que os fibroblastos sejam liseados. Sem remover o tampão de lise, adicione cuidadosamente dois mililitros de PBS a cada poço e, em seguida, aspire aproximadamente 2,5 mililitros.
Repita este processo duas vezes para um total de três lavagens. Após a lavagem final, adicione dois mililitros de PBS com pen-estreptococos. Sele a placa com filme e mantenha-a a quatro graus Celsius por até três meses.
Cultivar células HUVEC e EMB-2 com 2% de FBS até a confluência máxima. Em seguida, substitua o meio por EBM-2 sem FBS por oito horas. Para preparar as matrizes para semeadura celular, remova-as da geladeira e deixe-as em temperatura ambiente por uma hora.
Bloqueie as matrizes adicionando dois mililitros de 2%BSA desnaturados de calor e incuba-as a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, aspire o BSA e lave-os com dois mililitros de PBS. Semente 2 x 10 para o quinto huvec células para cada poço da placa revestida com matrizes derivadas de fibroblasto.
Incubar as células a 37 graus Celsius por 16 horas e examinar as estruturas semelhantes ao tubo sob um microscópio de campo brilhante padrão a 20-40x de ampliação. Este protocolo foi utilizado para examinar os efeitos do tratamento PDGF na formação de matriz derivada do fibroblasto. Os terceiros fibroblastos bgh incubados com PDGF mostraram uma distribuição celular mais alinhada em matrizes do que aqueles incubados sem PDGF.
A expressão da proteína de colágeno 1 e fibronectina foi aumentada em matrizes derivadas de fibroblastos estimulados pelo PDGF e, consequentemente, a espessura da matriz foi aumentada. Além disso, os histogramas direcionais demonstram que o colágeno 1 e a fibronectina apresentam padrões paralelos. Quando as células HUVEC foram semeadas em matrizes descelularizadas derivadas de fibroblastos estimulados pelo PDGF, elas desenvolveram estruturas mais capilares do que sob nenhuma condição estimulada.
Confirmando que matrizes derivadas de fibroblastos estimulados PDGF-BB promovem a ativação das células endoteliais. Ao realizar este procedimento, é importante preparar as soluções com antecedência e certificar-se de que as células estão prontas antes de iniciar. Além das células endoteliais, os estudos matrices também podem ser semeados com células epiteliais e a reação a fatores externos como condição na mídia ou drogas citotóxicas pode ser observada.
A geração de matriz extracelular é crucial no projeto de experimentos de macroambiente tumoral.
