Ce protocole permet de voir différents types de cultures et d’observer leurs interactions avec la matrice extracellulaire. Le principal avantage de cette méthode est que la matrice que vous obtenez est régénérée par fibroblaste et il sera assez similaire à ceux générés in vivo. Nous croyons que cette maladie n’est pas pertinente lors de l’utilisation de fibroblaste obtenir des plats de cuisson.
L’établissement d’une matrice à partir de ces cellules pourrait nous éclairer sur la façon dont elle peut entraîner, par exemple, une situation persistante. Ces méthodes peuvent également être appliquées, par exemple, aux études physiques aux survivants des bienséances matricielles. Visualisation de ce protocole, il est important d’observer une technique de pipetage des étapes que vous avez à régent.
Lorsque vous essayez ces méthodes pour la première fois, il faudra probablement plus de temps que prévu. Notre conseil est de préparer autant que vous le pouvez à l’avance et d’utiliser les périodes de durée pour se préparer pour les prochaines étapes. Commencez par préparer 0,2% de gélatine, 1% de glutaraldehyde et une solution d’éthanolamine molaire selon les directives manuscrites.
S’assurer d’exécuter chaque solution à travers un filtre de 0,22 micromètre avant utilisation. Ensuite, préparez l’acide ascorbique et le tampon de lyse. Diluer le stylo-strep PBS tel que décrit dans le manuscrit et préparer DMEM avec 10%FBS.
Préparer 2%BSA dénaturé par la chaleur en ajoutant 2 grammes de BSA à 100 millilitres d’eau stérile et en la réchauffant dans un bain d’eau bouillante pendant sept minutes. Puis, compléter FBS avec de la pénicilline, streptomycine, gentamicine, et amphotericine B.Culture télomères recombinants transfecté immortalisé fibroblastes de prépuce humaine et DMEM avec 10%FBS et les a maintenus à 37 degrés Celsius et 5% dioxyde de carbone. Pour établir la culture primaire de fibroblaste, coupez les échantillons de tissu en petits morceaux d’environ deux à trois millilitres en cubes et ensemencez-les dans fps avec une forte concentration d’antibiotiques.
Lorsque les premiers fibroblastes apparaissent, remplacez le milieu par un milieu FBM pour l’entretien cellulaire. Ajouter deux millilitres de solution gélatineuse de 0,2 % à chaque puits d’une plaque de six puits et l’incuber pendant une heure pendant 37 degrés Celsius ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, aspirer la gélatine et bien laver avec deux millilitres de PBS.
Ajouter deux millilitres de 1% de glutaraldehyde à chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant trente minutes, ce qui reliera la gélatine. Aspirer le glutaraldehyde et laver les puits en deux millilitres de PBS pendant cinq minutes. Pour bloquer le reste du glutaraldehyde, ajouter deux millilitres d’une éthanolamine molaire et incuber la plaque à température ambiante pendant trente minutes.
Aspirer l’éthanolamine et répéter les lavages avec PBS. Ajouter un millilitre de DMEM avec 10% fps. Si le milieu devient immédiatement rose, retirez-le, lavez les puits une fois avec deux millilitres de PBS et ajoutez un millilitre de DMEM.
Graine un millilitre de suspension fibroblaste avec 5 x 10 à la cinquième cellule dans chaque puits et la culture des cellules jusqu’à ce que 100% confluence est atteint. Retirez ensuite le milieu et remplacez-le par du DMEM avec 10 % de FBS et 50 microgrammes par acide ascorbique millilitre. Remplacer le milieu tous les deux jours pendant six jours.
Deux jours après le dernier traitement à l’acide ascorbique enlever le milieu et laver les puits avec deux millilitres de PBS. Après les lavages, ajouter lentement un millilitre de tampon de lyse préchauffé et incuber la plaque à température ambiante pendant cinq à dix minutes jusqu’à ce que les fibroblastes soient lysés. Sans enlever le tampon de lyse, ajouter soigneusement deux millilitres de PBS à chaque puits, puis aspirer environ 2,5 millilitres.
Répétez ce processus deux fois pour un total de trois lavages. Après le lavage final, ajouter deux millilitres de PBS avec pen-strep. Sceller la plaque avec du film et la garder à quatre degrés Celsius jusqu’à trois mois.
Cultivez les cellules HUVEC et EMB-2 avec 2%FBS jusqu’à la confluence maximale. Ensuite, remplacez le milieu par EBM-2 sans FBS pendant huit heures. Pour préparer les matrices pour l’ensemencement cellulaire, retirez-les du réfrigérateur et laissez-les à température ambiante pendant une heure.
Bloquer les matrices en y ajouter deux millilitres de 2%BSA dénaturés par la chaleur et les incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, aspirez le BSA et lavez-les avec deux millilitres de PBS. Graine 2 x 10 à la cinquième cellule HUVEC à chaque puits de la plaque recouverte de matrices dérivées du fibroblaste.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 16 heures, puis examiner les structures en forme de tube sous un microscope standard à champ lumineux à 20-40x grossissement. Ce protocole a été employé pour examiner les effets du traitement de PDGF sur la formation fibroblaste-dérivée de matrice. Les troisièmes fibroblastes de BGH qui ont été incubés avec PDGF ont montré une distribution cellulaire plus alignée dans les matrices que ceux incubés sans PDGF.
L’expression de protéine de collagène 1 et de fibronectin a été augmentée dans les matrices dérivées des fibroblastes PDGF-stimulés et par conséquent l’épaisseur de matrice a été augmentée. En outre, les histogrammes de directionnalité démontrent que le collagène 1 et la fibronectine montrent des modèles parallèles. Lorsque les cellules HUVEC ont été ensemencées sur des matrices décellularisées dérivées de fibroblastes stimulés par la PDGF, elles ont développé des structures plus capillaires que dans aucune condition stimulée.
Confirmant que les matrices dérivées des fibroblastes stimulés par PDGF-BB favorisent l’activation des cellules endothéliales. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de préparer des solutions à l’avance et de s’assurer que les cellules sont prêtes avant de commencer. Outre les études des cellules endothéliales matrices peuvent également être ensemencés avec des cellules épithéliales et la réaction à des facteurs externes comme l’état dans les médias ou les médicaments cytotoxiques peuvent être observés.
La génération de matrice extracellulaire est cruciale dans la conception des expériences de macroenvironnement de tumeur.
