このプロトコルは、異なるタイプの培養物を見て、細胞外マトリックスとの相互作用を観察することを可能にする。この方法の主な利点は、あなたが得るマトリックスが線維芽細胞によって再生され、それは生体内で生成されるものと非常によく似ているということです。私たちは、この病気は、ベーキング皿から得る線維芽細胞を使用する場合には無関係になると考えています。
これらの細胞から行列を確立することは、それがどのように影響するかを私たちに啓発することができます, 例えば, 永続的な状況.これらの方法は、例えば、マトリックスの妥当性から生存者に物理的研究に適用することができます。このプロトコルの視覚化では、摂起する必要があるステップのピペッティング技術を観察することが重要です。
これらのメソッドを初めて試すとき、おそらく予想以上に時間がかかります。私たちのアドバイスは、あなたが事前にできる限り準備し、次のステップの準備のために期間を使用する方法です。原稿の指示に従って0.2%ゼラチン、1%グルタルアルデヒドおよび1モルエタノールアミン溶液を調製することから始めます。
使用前に0.22マイクロメートルのフィルターを通して各溶液を実行することを確認してください。次に、アスコルビン酸およびリシスバッファーを調製する。原稿に記載されているようにPBSペンストレップを希釈し、10%FBSでDMEMを調製します。
100ミリリットルの無菌水に2グラムのBSAを加え、沸騰した水浴で7分間温めることで、熱変性した2%BSAを準備します。次に、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アンホテリシンB.Culture組換えテロメアを10%FBSでヒト包皮線維芽細胞とDMEMをトランスフェクトし、37°Cと5%の二酸化炭素でFBSを補った。一次線維芽細胞培養を確立するには、組織サンプルを約2〜3ミリリットルの小片に切り、高濃度の抗生物質でFPSに播種する。
最初の線維芽細胞が現れたら、細胞維持のために培地をFBM培地に交換してください。6ウェルプレートの各ウェルに0.2%ゼラチン溶液の2ミリリットルを加え、摂氏37度または摂氏4度で一晩1時間インキュベートします。インキュベーション後、ゼラチンを吸引し、2ミリリットルのPBSでそれぞれをよく洗います。
各ウェルに1%のグルタルアルデヒドを2ミリリットル加え、ゼラチンを架橋する30分間室温でプレートをインキュベートします。グルタルアルデヒドを吸引し、2ミリリットルのPBSで井戸を5分間洗浄します。残りのグルタルアルデヒドをブロックするには、1つのモルエタノールアミンを2ミリリットル加え、室温でプレートを30分間インキュベートします。
エタノールアミンを吸引し、PBSでの使用を繰り返します。10%FPSでDMEMを1ミリリットル加えます。メディアがすぐにピンク色に変わったら、それを取り除き、PBSの2ミリリットルで井戸を1回洗い、DMEMの別のミリリットルを追加します。
5 x 10で線維芽細胞懸濁液の1ミリリットルを各ウェルの5番目の細胞に播種し、100%合流するまで細胞を培養する。その後、培地を取り出し、10%FBSと1ミリリットルアスコルビン酸あたり50マイクログラムでDMEMに置き換えます。2日ごとに6日間培地を交換してください。
最後のアスコルビン酸処理の2日後に培地を取り除き、2ミリリットルのPBSで井戸を洗います。洗剤の後、予熱した溶液バッファーを1ミリリットルゆっくりと加え、繊維芽細胞が溶けるまで5〜10分間室温でプレートをインキュベートする。溶液バッファーを取り除かずに、慎重に各ウェルにPBSの2ミリリットルを追加し、約2.5ミリリットルを吸引します。
このプロセスを 2 回繰り返して、合計 3 回の操作を行います。最後の洗浄の後、ペンストレップでPBSを2ミリリットル加えます。フィルムでプレートを密封し、最大3ヶ月間摂氏4度に保ちます。
HUVEC細胞とEMB-2を最大合流まで2%FBSで成長させます。その後、8時間FBSなしでEBM-2で媒体を交換してください。細胞の播種用のマトリックスを準備するには、冷蔵庫から取り出し、室温で1時間放置します。
熱変性2%BSAの2ミリリットルを加えてマトリックスをブロックし、摂氏37度で1時間インキュベートします。その後、BSAを吸引し、2ミリリットルのPBSで洗浄します。第5種HUVEC細胞に第5種10を線維芽細胞由来マトリックスで被覆したプレートの各ウェルに。
37°Cで細胞を16時間インキュベートし、20〜40倍の倍率で標準的な明視野顕微鏡でチューブ状の構造を調べます。このプロトコルは、線維芽細胞由来マトリックス形成に対するPDGF治療の影響を調べるために使用された。PDGFと共にインキュベートされたBGH第3の線維芽細胞は、PDGFなしでインキュベートされたものよりもマトリックス中でより整列した細胞分布を示した。
コラーゲン1およびフィブロネクチンタンパク質発現は、PDGF刺激線維芽細胞由来のマトリックスにおいて増加し、その結果、マトリックス厚さが増加した。また、指向性ヒストグラムは、コラーゲン1とフィブロネクチンが平行パターンを示すことを示す。HUVEC細胞をPDGF刺激線維芽細胞由来の脱細胞化マトリックスに播種すると、刺激を受けた状態よりも毛細血管様構造が発達した。
PDGF-BB刺激線維芽細胞に由来するマトリックスが内皮細胞活性化を促進することを確認する。この手順を実行する場合は、事前にソリューションを準備し、開始する前にセルの準備ができていることを確認することが重要です。内皮細胞の研究のほかに、マトリックスは上皮細胞で播種することができ、また、メディアや細胞傷害性薬物の状態などの外部要因への反応を観察することができます。
腫瘍マクロ環境実験の設計において細胞外マトリックスの生成は極めて重要である。
