Name: breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation at JoVE.com

MG hibe K08DK101608 ve R03DK111473 Ulusal Sağlık enstitüleri, Mart, Dimes Vakfı Hibe No 5-FY17-79, çocuk Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi ve Anabilim Dalı tarafından desteklenmektedir Pediatri Washington Üniversitesi School of tıp, St. Louis. CJL R01DK104946 tarafından desteklenmektedir (PI: Silverman), çocukların Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi.

Bu çalışmada tüm hayvan yordamları St. Louis kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (iletişim kuralı 20160187) veya Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (iletişim kuralı 14103918) Washington üniversite tarafından kabul edildi. İnsan cenin ince bağırsak daha az 24 haftalık gebelik, Pittsburgh Üniversitesi anatomik doku tedarik kılavuzlarınıza uygun olarak kurumsal inceleme kurulu onayı (protokol PRO14100537) Üniversitesi'nden sonra elde edildi Pittsburgh Sağlık Bilimleri doku Bankası bir dürüst komisyoncu sistemi aracılığıyla. De-tanımlanan insan anne sütü veya pastörize donör anne sütü rıza Üniversitesi Pittsburgh Kurumsal değerlendirme Komitesi'nden feragat ile elde edildi.
1. crypt yalıtım ve Neonatal fareler veya erken insan ince bağırsak Enteroids kurulması
<ol><li>Medyası hazırlama Not: Medya crypt yalıtım önceki gün mahallede hazırlanmalıdır.<ol>
<li>1.11 L kültür ortamı hazırlamak. 4,5 g/M glikoz ve L-glutamin ile Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) 1 L ile başlayan ve 110 mL Fetal sığır Serum (FBS) (son konsantrasyonu % 10), 11 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1) ve 1.1 mL steril insülin (final Ekle konsantrasyon %0.1).</li>
		<li>500 mL PBS-antibiyotik karışımı hazırlayın. İle % 10 500 mL 1 x Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) ile başlayan FBS ve 5 mL gentamisin (son konsantrasyonu % 1), 1 mL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2), ekleyin ve 5 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1).</li>
		<li>30 mL hücre bozulma medya #1 hazırlayın. İlk 30 mL kültür ortamı hazırlamak. 600 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) eklemek (son konsantrasyonu 10 mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1) ve 60 µL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2).</li>
		<li>30 mL hücre bozulma medya #2 hazırlayın. İlk 30 mL kültür ortamı hazırlamak. 300 µL 0,5 M EDTA ekleyin (son konsantrasyonu 5 mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1) ve 60 µL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2).</li>
		<li>50 mL Crypt kültür medya büyüme faktörleri olmadan hazırlayın. Ölçmek 33.4 mL 1 x gelişmiş DMEM/F-12 ve 10 mL FBS (son konsantrasyonu % 20) ekleyin.<ol>
<li>500 µL eklemek penisilin-(son konsantrasyonu % 1), streptomisin 500 µL L-glutamin (son konsantrasyonu % 1), 500 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1), 100 µL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sülfonik asit (HEPES) (son konsantrasyonu 0.05 mM), 500 µL 100 mM N-Acetylcysteine (son konsantrasyonu 1 mM), 500 µL 100 x N-2 ek, A vitamini eksi serum ücretsiz ek (örneğin, B-27) x 1 mL 50 ve 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 mL Crypt kültür medya büyüme faktörleri ile hazırlayın. İlk 1 mL, Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri hazırlamak. 2.5 µL 40 µg/mL Wnt3a ekleyin (son toplama 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL kafa (son toplama 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (son konsantrasyonu 500 ng/mL) ve 0.5 µL 100 µg/mL EGF (son konsantrasyonu 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Crypt yalıtım
	<ol>
<li>Yer çözündürüldükten membran özü ( Tablo malzemelerigörmek) başlamadan önce çözülme buzda. Not: Devam membran buz veya polimerize.</li>
		<li>Ötenazi ile ikinci iki yöntemi ile fare fareler Yaş 14 günden daha büyük için kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi protokolü ile uyumlu, ötenazi ölüm emin olmak için fiziksel bir yordamı olmak. Not: fareler için 14 gün altında yaş, işten çıkarma makas kullanarak standart bir uygulamadır.</li>
		<li>Makas ve forseps kullanarak, cilt ve Periton, karın tüm uzunluğu için karın orta hat aşağı dikey bir kesi yapmak. İnce bağırsak mide çekum için makas ile tüketim ve Forseps ile bıçaklanmasından kaldırın. Not: İki-hafta-yaşlı erkek ve dişi C57BL/6J fare pups, her tartı 5,5-7 g crypt yalıtım için kullanılmıştır. Herhangi bir yaş veya boyutu fare crypt yalıtım için kullanılabilir.</li>
		<li>Taze hasat ince bağırsak crypt yalıtım için hazırlamak için bağırsak düz getirin ve bağırsak boyuna makas kullanarak tüm uzunluğu boyunca kesilmiş. Not: Fare ve insan bağırsak benzer şekilde hazırlanabilir.</li>
		<li>Temiz dışkı bağırsak sallayarak yavaşça bağırsak ve geriye bir PBS-antibiyotik karışım dolu forseps kullanarak kabında dışında.</li>
		<li>Hücre bozulma medya #1 30 mL 50 mL konik tüp ekleyin. Bağırsak 0,5 cm uzunlukta parçalara doğrudan tüp içine kesti. Tüp bir buz kovası ayarla ve yavaşça 15dk için en düşük hızda shaker üzerinde tahrik.</li>
		<li>Dokular üzerinde shaker olmakla birlikte, enteroids RNA, DNA veya protein yalıtım için kullanılacak ise kriptalarının büyümeye 24 veya 48 iyi tabaklar elde etmek. Eğer enteroids tamamı için kullanılmak üzere kriptalarının büyümeye kullanım 8-şey odası slaytlar confocal görüntüleme bağlayın.</li>
		<li>Başlık, membran 15 µL her şey 24 veya 48 iyi plaka altýna ekleyin. Odası slaytlar kullanıyorsanız, membran 9 µL her odası altýna ekleyin. Not: gerekirse plaka boyutuna göre membran seviyesini ayarlamak.</li>
		<li>Membran kuyunun üzerine ince bir tabaka oluşturur böylece membran pipet ucu hızla yayıldı. Kuluçka membran polimerize izin vermek 30 dk 37 ° C'de plaka yerleştirin. Not: Kriptalarının membran ince bir tabaka değilse veya membran hava kabarcıkları içeriyorsa eklemek.</li>
		<li>Bir shaker üzerinde 15 dk sonra doku 100 µm süzgeç aracılığıyla filtre. Aracılığıyla akış atmak.</li>
		<li>30 mL hücre bozulma medya #2 yeni bir 50 mL konik tüp ekleyin. Süzgeç dokuyu ve tüp ekleyin.</li>
		<li>Tüp bir buz kovası ayarla ve yavaşça 15dk için en düşük hızda shaker üzerinde tahrik.</li>
		<li>Shaker üzerinde 15 dk sonra doku 100 µm süzgeç aracılığıyla filtre. Akış'sonraki adımlarında verim düşüktür Bu adımda tutun. Not: Tüpler ile tüm akışı buz üstünde tutulmalıdır.</li>
		<li>15 mL DMEM 4,5 g/M glikoz ve L-glutamin ile yeni bir 50 mL konik tüp ekleyin. Süzgeç dokuyu ve tüp ekleyin. Şiddetle tüp el ile 10 s. filtre için 100 µm süzgeç aracılığıyla sallamak. ve akış toplamak. Akışı aracılığıyla hiçbir partiküller içeren kadar yineleyin.</li>
		<li>Mahallede aracılığıyla akış fare doku veya insan dokusu için 100 µm süzgeçler için 70 µm Süzgeçler kullanarak yeni 50 mL konik tüp içine önceki adımdaki filtre. Not: ilave süzgeçler çagirabilirim ve süzgeçler ile enkaz zarar gibi yavaş yavaş dökün.</li>
		<li>Tüp 4 ° C ve doğrudan yerinde bir buz kovası başlıklı 8 min için 200 x g de santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipet tarafından Pelet bozmadan kaldırın. Pelet toplam istediğiniz miktarı, Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri ile resuspend. Not: Zenginleştirilmiş kriptalarının Pelet 'kum' katmandır. Her 250 µL olan Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri de gerektirir.</li>
	</ol></li>
	<li>Enteroids kurulması
	<ol>
<li>Crypt medya karışımı membran üzerinde doğrudan plaka.</li>
		<li>Kriptalarının mikroskopla yalıtım işlemi başarılı oldu emin olmak için denetleyin. Not: Hücreleri ve hücre topları istenen. Yaklaşık 100 bireysel kriptalarının iyi kaplama.</li>
		<li>Plaka kriptalarının membran için bağlı kalmak izin vermek 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Bu kuluçka Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri ile değil.</li>
		<li>Yavaş yavaş medya ve P-200 pipet kullanarak iliştirmek başarısız fazlalık kriptalarının kaldırın. Not: ekteki kriptalarının yerinden olmak gibi membran rahatsız etmeyin.</li>
		<li>Yavaş yavaş 250 µL olan Crypt kültür medya ile büyüme faktörleri her şey için ekleyin. Not: 24-için 48-şey plakaları veya odası slaytlar, 250 µL olan Crypt kültür medya ile büyüme faktörleri yeterlidir.</li>
		<li>Ortamı 2 günde 5 gün kala en uygun ek ve büyüme için izin vermek için Tedaviler için taze Crypt kültür medya ile büyüme faktörleri ile değiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. fare meme süt toplama
<ol><li>C57BL/6J emzikli Barajı onun pups sağım öncesinde 6 h için doğum sonrası 7-12 gün ayırmak.</li>
	<li>Burun konisi üzerinden isoflurane ile emzikli Barajı anestezi ve oksitosin 0.15 IU/kg vücut ağırlığı, subkutan enjeksiyon yönetmek. Sağım yordamı denemeden önce 3 dakika bekleyin.</li>
	<li>Emzikleri yordamı sağım öncesinde % 70 etanol ile temiz ve kurumaya bırakın.</li>
	<li>Süt emzikleri bir fare emzikleri 5 mL toplama tüp içine sığacak şekilde boyutlandırılmış silikon tüp ile bir elektrik insan göğüs pompası kullanarak bir defada ayıklayın. Not: En iyi göğüs pompaları iki ayar, bir hız ve emme için var. Her birinin en düşük ayarlarla başlatın ve her ikisi de yavaş yavaş süt elde edilir kadar artırmak en iyisidir. İdeal olarak, toplam verim olacaktır ~ 500 µL - fare anne sütü emzikli dam başına 1 mL.</li>
	<li>Hemen aliquot anne sütü ve mağaza-80 ° C'de Not: önlemek donma/çözülme döngüsü.</li>
	<li>37 ° C'de 24 h için fare anne sütü mL Crypt kültür medya büyüme faktörleri ile başına 50 µL/mL 5 gün enteroids tedavi</li>
</ol>3. bütün Enteroids boyama Mount
<ol><li>
Reaktifler hazırlanması
	<ol>
<li>16 mL 1 x PBS 8 kuyu başına hazırlayın.</li>
		<li>2 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) 8 kuyu başına 1 x PBS hazırlayın.</li>
		<li>2 mL % 0,1 hazırlamak 8 kuyu başına 1 x PBS Triton X-100.</li>
		<li>24 mL hazırlamak PBS ara (PBST ise % 0.1 ara 20 içinde 1 x PBS) 8 kuyu başına.</li>
		<li>%0,1 2 mL % 10 normal eşek serum (NDS) hazırlamak PBST (% 10 NDS/PBST) 8 kuyu başına.</li>
		<li>4 mL % 1'i hazırlayın NDS % 0,1 PBST (% 1 NDS/PBST) 8 kuyu başına.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1. gün boyama
	<ol>
<li>Tedaviler Aspire edin ve enteroids PBS ile yıkayın. 250 µL % 4 eklemek PFA ücret iyi. Rotator için 1-2 h 4 ° C'de yerleştirin %4 kaldırmak PFA pipet ile.</li>
		<li>Yıkama 250 µL/kuyu 1 ile 4 kez PBS x. Rotator (RT) oda sıcaklığında 10 dakika yerleştirin. Not: Bu plaka gerekirse 1-2 gün 4 ° C'de depolamak mümkündür.</li>
		<li>250 µL/iyi 0,1 Ekle % Triton X-100. RT Kaldır, 1 h için kuluçkaya % 0,1 Triton X-100 pipet ile.</li>
		<li>Yıkama 250 µL/kuyu 1 ile 4 kez PBS x. Rotator RT. itibariyle 15 dakika yerleştirin</li>
		<li>250 µL/iyi %10 eklemek NDS/PBST. RT Kaldır, 45 dk için kuluçkaya % 10 NDS/PBST pipet ile.</li>
		<li>250 µL/iyi birincil antikor, seyreltilmiş 1 %1/250 NDS/PBST, eklemek ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: Optimum antikor seyreltme üreticisine göre değişir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2. gün boyama
	<ol>
<li>4-5 h ile 250 µL/iyi PBST için en az 5 kez yıkayın. 4 ° C arasında her yıkama rotator yerleştirin.</li>
		<li>250 µL/iyi ikincil antikor, seyreltilmiş 1 %1/1.000 NDS/PBST ekleyin. Plaka folyo sarın ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3. gün boyama
	<ol>
<li>250 µL/iyi nükleer 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15dk için leke ekleyin. Not: plaka karanlıkta bırakın.</li>
		<li>6 kez 250 µL ile/iyi PBST yıkayın. Rotator her yıkama arasında 4 ° C'de 10 dakika yerleştirin.</li>
		<li>Mount coverslip odası üzerinde slayt ortam takma ile.</li>
		<li>40 X objektif confocal mikroskop ile fotoğraf çekmek ve eşit bir raster grafik editörü render ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+prebiotics,+probiotics,+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis:+what+is+the+current+evidence?.">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?.</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li><li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis.">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li><li>Henry, M. C., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis.">Necrotizing enterocolitis.</a> Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).</li><li>Lin, P. W., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotising+enterocolitis.">Necrotising enterocolitis.</a> Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).</li><li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis.">Necrotizing enterocolitis.</a> N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).</li><li>Bartick, M., Reinhold, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+suboptimal+breastfeeding+in+the+United+States:+a+pediatric+cost+analysis.">The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis.</a> Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).</li><li>Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+necrotizing+enterocolitis+on+length+of+stay+and+hospital+charges+in+very+low+birth+weight+infants.">Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants.</a> Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Gribar, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+expression+and+signaling+of+TLR4+and+TLR9+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+necrotizing+enterocolitis.">Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.</a> J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+fluid+inhibits+Toll-like+receptor+4+signaling+in+the+fetal+and+neonatal+intestinal+epithelium.">Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+protects+against+the+development+of+necrotizing+enterocolitis+through+inhibition+of+Toll-like+receptor+4+in+the+intestinal+epithelium+via+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).</li><li>Yazji, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TLR4+activation+impairs+intestinal+microcirculatory+perfusion+in+necrotizing+enterocolitis+via+eNOS-NO-nitrite+signaling.">Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glutamine+supplemented+parenteral+nutrition+on+the+incidence+of+necrotizing+enterocolitis,+nosocomial+sepsis+and+length+of+hospital+stay+in+very+low+birth+weight+infants.">Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants.</a> Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+decreases+lipopolysaccharide-induced+intestinal+inflammation+in+infant+rats.">Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+oligosaccharide+2'-fucosyllactose+attenuates+the+severity+of+experimental+necrotising+enterocolitis+by+enhancing+mesenteric+perfusion+in+the+neonatal+intestine.">The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine.</a> Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).</li><li>Jantscher-Krenn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+oligosaccharide+disialyllacto-N-tetraose+prevents+necrotising+enterocolitis+in+neonatal+rats.">The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats.</a> Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).</li><li>Akin, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+lactoferrin+to+prevent+nosocomial+sepsis+and+necrotizing+enterocolitis+of+premature+neonates+and+effect+on+T-regulatory+cells.">Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells.</a> Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).</li><li>Amin, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+supplementation+prevents+necrotizing+enterocolitis+in+the+premature+infant.">Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant.</a> J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).</li><li>Rodgers, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+milk+collection+in+the+rat.">Practical aspects of milk collection in the rat.</a> Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).</li><li>DePeters, E. J., Hovey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+collecting+milk+from+mice.">Methods for collecting milk from mice.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).</li><li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves'+muntjac+deer.">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Drummond, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner.">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek hiçbir şey ve hiçbir çıkar çatışması var.

Bağırsak epitel konak savunma bağırsak bariyer bütünlüğünü korumak patojenlere karşı sorumluluğunuz vardır ve çeşitli hastalıkların patogenezinde çiğnenebilmektedir birçok hücresel türlerinden oluşur. Hayvan modelleri hastalık bazı yönleriyle özetlemek, fareler ve insanlar bağırsağın türetilmiş enteroids ex vivo modelinin çeşitli tedaviler etkilerini test etmek için bir platform sağlar. Enteroid modeli önemini araştırmacılar kültür ve bağırsak kök hücre saf ya da h...

Enterokolit Nekroze edici (NEC) gastrointestinal hastalığı etkileyen yaklaşık 28 hafta gebelik1,2,3önce tarihi 1 10 bebeklerde prematüre bebeklerde ölüm önde gelen nedenidir. Yarısı, bebeklerin hayatta kalma sadece % 10-304,5nerede en ağır formu için NEC ilerleme ile. Amerika Birleşik Devletleri'nde bir tahmini 2-3 milyar YTL/yıl harcanan bebekler NEC6,7ile tedavi henüz ne sağkalım oranı ne de terapi son 30 yıl içinde değişti. NEC patogenezinde bağırsak yaralanma ile karakterizedir ve Mukozal iyileşme8,9,10,11, ancak, bir yaygınlaşacak önde gelen sinyal yolları Engelli inflamatuar yanıt ve inflamasyonu tersine çevirmek için mekanizmaları tam olarak anlaşılır kalır.
İnsan anne sütü yönetim prematüre bebekler için NEC karşı strateji sadece koruyucu olduğu tespit edilmiştir. Biz daha önce anne sütü NEC geliştirme yolu ile yolu11sinyal epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) bağırsak epitel içinde doğuştan gelen bağışıklık reseptör toll benzeri reseptör 4 (TLR4) inhibisyonu yoluyla karşı korur göstermiştir. Anne sütü deneysel bir NEC Formula takviyesi Enterocytes apoptosis inhibisyonu ve restorasyon epidermal büyüme üzerinde bağımlı bir şekilde Enterocytes yayılması tarafından gösterildiği gibi NEC görüldüğü inflamatuar yanıt zayıflatılmış faktör (EGF) ve EGFR11. Başka bir çalışmada, o göstermek bu nitrat, başka bir bileşeni olan anne sütü, koruyucu doğası ile karşılaştırıldığında hangi NEC yüksek frekans için katkıda bulunabilir ve nitrat eksik bebek formülü, bağırsak perfüzyon oransal tarafından katkıda bulunur formülü bebeklerin12,13beslenir. İnsan sütü oligosakkaritler, L-Arginin, glutamin ve Laktoferrin14,15,16, anne sütü mevcut NEC karşı koruma dahil olmak için gösterilen diğer bileşikler içeren 17,18,19. Anne sütü yararlı bu unsurları NEC önlenmesinde kullanımı gerekliliği ortaya, ama aynı zamanda yollar ve hücresel etkileri anne sütü NEC karşı koruma arabuluculuk nasıl içinde ilgili sinyal mekanizmaları, eğitim önemini vurgulamak .
İleri çalışmalar amacıyla anne sütü, NEC, fare modeli koruyucu özelliklerini biz hangi fare tarafından anne sütü bir elektrik insan meme pompası11,12 kullanarak bir imzalat Barajı elde edilebilir bir roman, kullanımı kolay tekniği gelişmiş . Fare anne sütü edinme Bu strateji değil bu yöntem species-specific meme süt analizleri için verdiğinden yalnızca insan göğüs pompaları ama aynı zamanda hazır ve anne sütü, tedarik verimli olduğundan avantajlıdır. Sonuç olarak, biz fare anne sütü etkileri bu insan sütünü ile karşılaştırabilirsiniz yanı sıra species-specific modelleri süt bankada insan donör süt pastörize. Meme süt bileşenleri ile ilgili olarak yaptıkları katkı NEC önleme yolunda çalışması için bu teknik sağlar. Diğer araştırmacılar meme süt çıkarma yöntemleri geliştirdik, ancak, bu teknikleri el ile ve genellikle birden fazla laboratuvar üye20,21,22gerektirir. Burada bir fareden süt toplamak için bir insan elektrikli göğüs pompası değiştirerek kullanılabilir bir basit tekniği sunulur. Bu teknik diğer türler için de uygulanabilir.
Yeterli sinyal yolları NEC ile ilgili sorguya çekmek için model sistemleri tüm hastalık sürecinde etkilendiği bilinen farklı hücre türleri değerlendirmek için ihtiyaç vardır. Burada, bir tür modeli sistemi - enteroids - ve kendi kuruluş fare ve insan ince bağırsak tartışmak. Gastrointestinal sistem gerçekleşecek patofizyolojik süreçlerin çalışmada yardım etmek için bir yenilikçi, genetik olarak farklı ex vivo insan modeli sundukları çünkü insan bağırsak enteroids (HIEs) özellikle önemli söz, sağlamak 23. Enteroids uzun vadeli kültürlü tespit edilmiştir ve daha sonra kullanım23için dondurulmuş ve insan bağırsak olan kültürler indüklenebilir pluripotent kök hücrelerden gelişmiştir, Organoids farklı olarak (HIOs), kök hücrelerden enteroids oluşturulur izole bağırsak kriptalarının24içinde. Enteroids daha az bakım gerektiren, olabilir hızlı bir şekilde25enfekte ve bağırsak kriptalarının daha HIOs23farklılaşmış beri kolayca kurulabilir. Bu nedenle, insan gastrointestinal epitel23bölgeye özel kompozisyon ve fonksiyonel özellikleri sergilemek geliştirilebilir çünkü HIEs mevcut teknikleri birçok avantajlar sunuyor. Enteroids kullanımı ihtiyacı olan bir insan modeli bağlılık bölgeye özgü sınırlamalar ve kullanım kolaylığı ile bağırsak ne zaman son derece etkili bir seçimdir. Burada izole edip birincil kök hücre kaynaklı küçük bağırsak enteroids fareler ve prematüre insan bebeklerin bakımını yapma tekniği göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulin)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Tube</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 Inch Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Human Double Electric Breast Pump</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Test Tube</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Stoppers</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Human Mki67 primer F: 5&#039;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#039; R: 5&#039;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#039;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

İnsan küçük bağırsak enteroids kriptalarının türetilmiştir ve kök hücre niş içinde yetiştirilen epitel hücre türlerinin tümünü içerir. İnsan enteroid ex vivo kültür sistemleri kurmak için yetenek modeli bağırsak patofizyolojisi ve belirli hücresel yanıt dahil çalışma gerekir. Son yıllarda, enteroids fareler ve insanlar, pasajlı ve banked uzakta birkaç laboratuarlarında ileride kullanmak için dünya çapında kültürlü. Bu enteroid platformu çeşitli tedaviler ve ilaçlar etkilerini ve farklı hücre tipleri bağırsak üzerinde ne gibi etkileri sarf test etmek için kullanılabilir. Burada, birincil kök hücre kaynaklı küçük bağırsak enteroids kurmak için bir protokol yenidoğan fareler türetilen ve erken insan bağırsak sağlanır. Ayrıca, bu enteroid kültür sistemi species-specific anne sütü etkilerini test etmek için kullanılmıştır. Fare anne sütü verimli bir şekilde değiştirilmiş insan göğüs pompası kullanılarak elde edilebilir ve ifade fare süt o zaman daha fazla araştırma deneyler için kullanılabilir. Biz şimdi ifade fare, insan, etkileri göstermek ve neonatal fareler veya erken insan ince bağırsak donör anne sütü büyüme ve enteroids yayılması türetilmiş.

İlk insan anne sütü ifade olup olmadığını araştırmak aranan veya pastörize donör anne sütü küçük bağırsak enteroids üzerinde bir etkisi vardı. Nitekim, insan anne sütü ve donör anne sütü yenidoğan fare (şekil 1A) ve erken insan türetilmiş enteroids (şekil 1B) büyüme arttı.
Bu yana insan anne sütü küçük bağırsak enteroids büyüme ...

Watch this Scientific Journal Video about Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation at JoVE.com

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Anne sütü artırır büyüme Enteroids: hücre çoğalması bir Ex Vivo modeli

Bu iletişim kuralı, Yenidoğan fare veya erken insan bağırsak yanı sıra fareler süt toplamak için verimli bir yöntem bir enteroid kültür sistemi kurmak açıklar.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. Bu iletişim kuralı, Yenidoğan fare veya erken insan bağırsak yanı sıra fareler süt toplamak için verimli bir yöntem bir enteroid kültür sistemi kurmak açıklar.

Video: Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Biyomühendislik

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Kanser Araştırmaları

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Fetal Intestinal Organoidler Kullanılarak Tüp Bebek Teyidi--Weaning Geçiş

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Tıp

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Fare Modeller Meme Bezi Geliştirme ve Fonksiyon Değerlendirme

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Biyoloji

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...