Bu protokol, hastanın kendi trombosit bakımından zengin plazması ve beş dakika boyunca standartlaştırılmış bir preparat ile insan fibroblast kültürü için otolog bir sistemdir. PRP, kültürde fibroblastın büyük bir hücre genişlemesini teşvik eder. Otolog hücre tedavileri için masif dere ve güvenli hücre genişlemesine ihtiyaç duyduğunuzda PRP'yi hücre takviyesi olarak kullanarak bu yöntemi kullanmanızı tavsiye ederim.
Bu protokolü denediğinizde PRP bütünlüğünü kontrol etmenizi tavsiye ederim. Plazmanız, kırmızı kan hücrelerinin yokluğunda çok temiz olmalıdır. Aktardığınızda, çok dikkatli bir şekilde yapmanız gerekir.
Ve dokunuzun sindirimi ile ilgili olarak, devam etmeden önce çok temiz olması gerekir. Başlamak için, kanı antikoagülanla karıştırmak için kanla dolu trombosit bakımından zengin plazma veya PRP tüplerini dikkatlice üç kez baş aşağı çevirin. Kan örneklerini sabit 45 derecelik açılı bir rotorda beş dakika boyunca 1500g'de santrifüj edin ve tüpleri dengeleyin.
Santrifüjlemeden sonra, fraksiyone edilmiş kan, jelin yüzeyindeki ayırıcı jel ve trombositlerin altında sıkışmış kırmızı ve beyaz kan hücrelerine sahiptir. Plazma süpernatanındaki trombosit birikintisini yeniden askıya almak için PRP tüpünü 20 kez yavaşça ters çevirin. Trombositlerin jelden tamamen ayrıldığından ve plazmanın berrak ve şeffaftan bulanıklığa değişmesinden emin olun.
10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı bir transfer cihazı kullanarak plazma çözeltisini tüpten toplayın. Cilt örneklerini PBS ile 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe yerleştirin ve tüpü yavaşça sallayın. Cilt örneği nispeten büyükse, epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde 150 santimetrekarelik bir doku kültürü kabının kapağına yerleştirin.
Bir çift forseps ve makas kullanarak deri altı yağ dokusunu çıkarın. Dokunun kurumasını önlemek için, PBS'de birkaç dakikada bir dokuyu durulayın. Yağ alımı tamamlandığında, cilt örneklerini yaklaşık 0,5 x 1,5 santimetre şeritler halinde kesmek için bir neşter kullanın.
Daha sonra, steril 15 mililitrelik bir tüpe beş mililitre Kollajenaz / Dispase karışımı ekleyin. Kesilen dokuyu tüpe aktarın. Doku parçalarının çözeltiye batırıldığından emin olun ve tüpü güvenli bir şekilde kapatın.
Tüpleri 150 dakika boyunca orbital sallanarak 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, dokuyu içeren tüpü biyogüvenlik kabinine taşıyın. 100 milimetrelik steril bir kültür kabının kapağını biyogüvenlik kabinine baş aşağı yerleştirin.
Doku süspansiyonunu sıçramadan 100 milimetrelik kültür kabının altına aktarın. Tüpte herhangi bir doku parçası kalırsa, parçaları kültür kabının altına aktarmak için steril bir mililitrelik pipet veya steril forseps kullanın. Epidermis yukarı bakacak şekilde, dermisi bir çift forseps ile tutun.
Epidermisin kenarını başka bir forseps çifti ile kavrayın ve dermis ile epidermisi birbirinden ayırın. Ayrılan parçaları aynı kapakta tutarak, dermal parçaları PBS içeren yeni bir 100 milimetrelik kültür kabına yerleştirin. Daha sonra, laboratuvar forsepslerini kullanarak, dermal parçaları üç mililitre% 0.3 Tripsin PBS içeren 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın.
Tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe edin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek içeriği her iki ila üç dakikada bir karıştırın. 10 ila 20 dakika sonra, üç ila beş mililitre buz gibi soğuk tam büyüme ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun. Tüpü birkaç kez kuvvetlice vorteksleyin.
Fibroblastları içeren süspansiyonu 85 mikronluk bir naylon ağdan 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin. Fibroblast çözeltisini 150 g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve hücre sayımı için hücre peletini 100 ila 200 mikrolitre tam büyüme ortamında yeniden askıya alın.
Hücreleri 25 santimetrekarelik bir doku kültürü şişesinde kaplayın. Ardından, şişeyi 37 santigrat derecede inkübe edin. Yapışkan olmayan hücreleri içeren ortamı ertesi gün ve yine her üç ila dört günde bir değiştirin.
Fibroblastlar% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, PBS ile yıkayın ve Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Şişeyi 37 santigrat derecede üç dakika inkübe ettikten sonra, üç ila beş mililitre sıcak tam büyüme ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından, hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 200 g'da santrifüj edin.
Süpernatantı aspirasyonla çıkarın. PRP ortamında fibroblastları kültürleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Önerilen minimum hücre yoğunluğu, santimetre kare başına 4.000 canlı hücredir.
10 farklı hastadan tam kan işlenerek PRP üretmek için özel bir tıbbi cihaz kullanıldı. Cihaz, kırmızı kan hücrelerinin ve beyaz kan hücrelerinin çoğunu çıkardı. PRP'deki ortalama trombosit konsantrasyonu, tam kandaki trombosit konsantrasyonundan yaklaşık %50 daha yüksekti.
Otolog fibroblastlar% 10 FBS ile ortamda veya% bir ila% 50 arasında değişen PRP konsantrasyonlarına sahip ortamlarda yetiştirildiYedi günlük kültürden sonra, ortamı değiştirmeden,% 20 PRP ile hazırlanan kültürler daha fazla sayıda canlı fibroblast sergiledi. PRP, FBS'ye kıyasla 7.7 kata kadar proliferasyon arttırıcı olarak güçlü etkilere sahipti. Phalloidin boyaması, PRP aktivasyonu üzerine gözlenen morfolojik değişikliğin, fibroblast aktivasyonunun bir imzası olan F-aktin reorganizasyonu ile ilişkili olduğunu göstermiştir.
Hızlı hücre genişlemesinin önemli bir endişesi, genomik modifikasyon riskidir. Bunu değerlendirmek için, hücrelerinizin genomik stabilitesini değerlendirmek için karşılaştırmalı genomik hibridizasyon testi yapabilirsiniz. Bu tekniğin temel avantajı, FBS'yi daha güçlü bir otolog biyolojik takviye olan bir PRP ile değiştirmektir.
Bununla, araştırmacı herhangi bir ksenojenik madde ilavesi olmadan daha hızlı hücre büyütebilir. Bu tekniği klinik uygulamadan önce ex vivo genişlemeye ihtiyaç duyan diğer hücre tipleri için de kullanabiliriz, örneğin keratinosit veya mezenkimal kök hücre.
