Protokol deniz omurgasızlar için kullanımı kolay ve yaygın olarak uyumlu birincil hücre kültürü yöntemi sağlar. Bu teknik araştırmacılarnispeten uzun süre deniz omurgasız hücreleri kültür için bir yol verir. Deniz biyolojisi araştırmalarında farklı biyolojik deneysel uygulamalar için tutarlı genetik arka plan ile hücre kültürü sağlanmalıdır.
Bu alandaki yeni araştırmalara göre, belirtilen basitleştirilmiş protokolün egzersiz yapmak için iyi bir seçim olması gerektiğine inanıyoruz. Anesteziden sonra ön bağırsakları inceleyin ve toplayın, ardından doku örneklerini dikey olarak kesip iç içeriğini çıkarın. Doku örneklerini PBS'de iki kez yıkayın ve %75 etanol çözeltisi içinde iki saniyeden fazla bir sürede batırarak dezenfekte edin.
Daha sonra etanol kaldırmak için PBS doku örnekleri üç kez yıkayın ve iki mililitre steril mikro santrifüj tüp içine doku örneği yaklaşık 100 miligram aktarın. Deniz hıyar bağırsak dokusu bloğuna önceden optimize edilmiş kültür ortamının 1,5 mililitresini ekleyin ve çözelti bulutlu olana kadar sterilcerrahi makasla bloğu doğrama. % 0.25 tripsin 400 mikrolitre ekleyin.
Inversion tarafından çözelti karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka. Daha sonra 100 mikron hücreli süzgeç kullanarak çözeltiyi filtreleyin ve yeni bir steril iki mililitrelik mikro santrifüj tüpiçinde filtrat toplamak. İsteğe bağlı basitleştirilmiş protokol için, kültürlü ortamda kesilen doku blokları doğrudan yemeklere aktarılabilir ve daha sonra kuluçkaya yatırılabilir.
Üç dakika için 1700xG tüp santrifüj, supernatant atın, sonra antibiyotik ile kültür ortamda pelet yeniden askıya, ve kültür orta ile iki kez yıkayın. Hücre kültürü için kuluçka makinesini önceden ayarlayın ve 18 santigrat derece sıcaklık ve doymuş nem ile en az 24 saat önceden çalıştırın. Daha sonra 200 mikrolitre belirtilen ortamı kullanarak hücreleri yeniden askıya alın ve dört santimetrelik yemeklere aktarın.
Kültür bir kuvözdeki hücreleri. Altı saat sonra, kuvöz onları almak ve hücre culturing yemekleri için belirtilen orta iki mililitre ekleyin. Her 12 saatte bir, ortamın yarısını değiştirin.
Beş ila yedi gün sonra hücreler bölünmeye başlar. Belirtilen antibiyotiklerin konsantrasyonu azaltarak antibiyotiklerin yan etkilerini azaltmak, penisilin, streptomisin, ve gentamisin kültür orta yarısında. Her 2-3 günde bir, hücre kültürü ortamını değiştirin.
Birincil hücre yoğunluğu %60'a ulaştığında hücre geçişini gerçekleştirin. İlk olarak, oda sıcaklığında PBS kullanarak iki kez kültürlü hücreleri yıkayın. Her tabağa %0,25 tripsin çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin ve tüm alt kısmı kaplanmasını sağlayarak bulaşıkları elle çalkalayın.
Tripsin çözeltisini atın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri bir mililitre taze kültür ortamıyla borulama ve yeniden askıya alarak yıkayın. 0,5 mililitre hücre süspansiyonunun yeni bir tabağa aktarılması.
Taze orta 1,5 mililitre ekleyin ve 18 santigrat derece hücreleri kuluçka. 12 saat sonra ortamı değiştirin ve koşulları değerlendirmek için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Bir mikromolar ve 100 mikromolar deximethazone ile bir kontrol ve iki çözüm grubu da dahil olmak üzere üç deneysel grup hazırlayın.
Sıfır, 24 veya 48 saat deximethazone ile veya olmadan kuluçka sonra, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Işığı kapattıktan sonra, 12 kuyu plakasına her kuyubaşına 300 mikrolitre çapak 33258 çözeltisi ekleyin ve tüm hücreleri kapsayacak şekilde plakayı hafifçe çalkalayın ve boyamalarını sağlar. 30 dakika boyunca 18 derecede kuluçkaya yat.
Daha sonra hoechst boyama çözeltisini çıkarın ve her kuyuya PBS'de yüzde dört paraformaldehit çözeltisinin 300 mikrolitresini ekleyerek hücreleri düzeltin. Yavaşça 15 dakika boyunca çalkalayın. Bundan sonra, PBS sabit hücreleri üç kez yıkayın.
Hücreleri kapalı tutmak için son yıkama dan sonra PBS tutun. Cıva lambası gücü, floresan ışık gücü ve PC dahil olmak üzere floresan mikroskop donanımını açın. İşletim sistemi hesabına giriş yapın, yazılımı başlatın ve yapılandırmasını kontrol edin. Hazırlanan plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin.
Sahne denetleyicisini kullanarak örneği nesnel merceğin üzerine yerleştirin. Işık mikroskobu altında ilgi hücreleri bulun. Floresan mikroskopiye geçin ve çekirdek DNA gözlemi için uyarma ve emisyon parametrelerini sırasıyla 352 ve 461 nanometreye ayarlayın.
Görüntüleri yakalayın. Bu çalışmada deniz hıyarı birincil bağırsak hücre kültürü kurulmuş ve geçilmiştir. Culturing farklı aşamalarında yuvarlak hücreler burada gösterilmiştir.
Burada üçüncü gün, tohumlu sonra yemeklerin altına bağlı hücrelerdir. İşte yedinci gün hücre çoğalması. Burada geçen sonra yemeklerin altına bağlı hücreler vardır.
Ve 10 pasajdan sonra aktivitesini kaybeden ve ölmekte olan hücreler. EDU belirterek tahliller daha sonraki aşamalarında bu yuvarlak hücrelerin proliferatif aktivitesini ortaya çıkarmak için doğrudan kanıt sağlar. Bir mikromolar deximethazon ile stimülasyon en hızlı apoptotik hücre hızı arttı, kontrol ve 100 mikromolar deximethazon stimülasyon ile karşılaştırıldığında.
Kültürlü hücreler farklı zaman dilimleri için deximethazon ile tedavi edildi, ardından hoechst 33258 apoptotik hücre tespiti için boyama yapıldı. Kuluçkadan önce hücre tedavileri uzun süreli kontrol için çok önemlidir. Hücre iyi büyümediğinde isteğe bağlı basitleştirilmiş protokolü denemek için bir hatırlatmadır.
Paraformaldehit cilt teması veya teneffüs ile orta derecede toksik, ve muhtemelen bir insan kanseriojen olarak belgelenmiştir.
