Bu protokolün örnekler arası değişimi kaldırmak için kullanılması, mRNA ve protein düzeyleri arasındaki numune içi tutarsızlıklara dayalı makromoleküllerin diferansiyel regülasyonu hakkında öngörüler sunabilir. DNA, RNA ve proteini izole etmek için aynı örneği kullanmak değişkenliği azaltmak, tekrarlanabilirliği artırmak ve yorumlamayı kolaylaştırmak için bir girişimdir. Avantajlar, numune toplama ve değerli ve sınırlı numunelerin kesit analizi sırasında kaydedilen zaman ve kaynakları içerir.
Başlamak için, uygun büyüme koşulları ile bir 10 santimetre plaka içinde tohum 1,000 solucan yumurtası. 72 saat boyunca 20 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, 5 mililitre M9 tamponu ile plakayı yıkayın ve 1.000 yetişkin solucanı bir tüpe aktarın.
Solucanları 1,000 g'da bir dakika lığına santrifüj edin, süpernatantı atın ve bir mililitre M9 tamponuyla peletlenmiş solucanları 1,5 mililitrelik mikrosentrifüge tüpüne aktarın. Bir dakika için 845 g tekrar santrifüj ve supernatant en atın. Peletlenmiş solucanları eksi 80 derecede dört saatten fazla saklayın.
Daha sonra, çözülmüş pelet herhangi bir supernatant kaldırın. Bir mililitre soğuk GTCP reaktifi ekleyin, yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın ve numuneyi 10 dakika boyunca buzüzerine yerleştirin. Sonra, soğuk kloroform 200 mikrolitre ekleyin.
Tüpü 15 saniye boyunca şiddetle çalkalayın ve oda sıcaklığında üç dakika bekletin. Sonra, 13, 500 g dört santigrat derece 15 dakika boyunca tüp santrifüj. Bir mikro pipet ile, yeni bir RNase-free 1.5 mililitre mikro-santrifüj tüp içine net üst tabaka aktarın.
Bulutlu beyaz interfaz tabakasını B2 etiketli yeni bir tüpe aktarın ve pembe katmanı kalan peletten B etiketli yeni bir tüpe aktarın ve her ikisini de buza yerleştirin. Üç katmanı açıkça ayırmak zor olabilir. Bu tabakadan gelen DNA'yı organik ya da pembe tabakadan çöktürmektense bulutlu interfaz tabakasını kendi tüpüne aktarmanızı öneririm.
RNA izole etmek için, ilk RNA çöktürmek için tüp A için% 100 isopropanol 500 mikrolitre ekleyin. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra tüpü 13, 500 g'da 4 derece santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Sonra, supernatant atın ve pelet yıkamak için tüp A% 75 etanol bir mililitre ekleyin. Tüpü 5, 300 gr'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve pelet 5 ila 10 dakika kuru izin.
RNA pelet yeniden oluşturmak ve 10 dakika boyunca 55 ila 60 santigrat derece pelet kuluçka ya da rNase içermeyen su 50 mikrolitre ekleyin. Son olarak, 260 nanometre de izole RNA konsantrasyonu ölçmek ve 230 ve 280 nanometre herhangi bir yabancı maddeleri belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. DNA'yı izole etmek için, önce B tüpündeki organik faza ve B2 tüpündeki bulutlu beyaz tabakaya 300 mikrolitre ekleyin, DNA'yı çökeltin, ters çevrilerek karıştırın ve tüpleri oda sıcaklığında iki ila üç dakika bekletin.
Sonra, santrifüj tüplerI B ve B2 376 g dört santigrat derecede beş dakika boyunca DNA pelet. B ve B2 tüplerinden gelen süpernatantı C etiketli yeni bir iki mililitrelik tüpte birleştirin ve sonraki protein izolasyonu için buzda bırakın. Daha sonra, 30 dakika boyunca% 10 etanol 0.1 molar sodyum sitrat bir mililitre ile tüp B2 DNA pelet yıkayın.
Santrifüj tüp B2 376 g dört santigrat beş dakika için santigrat g. Yıkama adımını tekrarlayın ve peleti 1,5 mililitre %75 etanolde tekrar askıya alın ve 20 dakika oda sıcaklığında bırakın. Sonra, santrifüj tüp B2 376 g dört derece santigrat beş dakika ve sonra supernatant atın ve pelet beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin.
Sekiz mililitre sodyum hidroksit 150 mikrolitre pelet çözün. Sonra, numuneyi 376 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Son olarak, bir mikropipet ile, yeni bir tüp DNA içeren supernatant aktarın.
İzole DNA konsantrasyonu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın 260 nanometre ve 230 ve 280 nanometre herhangi bir yabancı maddeleri tanımlamak için. Proteini çökeltmek için, ilk olarak 1,5 mililitreye kadar %100 isopropanol ekleyin, c tüpündeki pembe süpernatana, birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sonra, 13, 500 g'da 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede c'de santrifüj tüpü.
Supernatant atın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 95 etanol 0.3 molar guanidin hidroklorür iki mililitre ile pelet yıkayın. Tüpü tekrar 5, 300 g'da dört santigrat derecede beş dakika bekleyin ve yıkama adımını eskisi gibi tekrarlayın. Protein peletini C2 etiketli yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve 1,5 mililitreye kadar %95 etanol, girdap ekleyin ve 20 dakika oda sıcaklığında oturmasına izin verin.
Tüpü 5, 300 gr'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve 10 dakika oda sıcaklığında pelet kuru masını bekleyin. Daha sonra, 60 dakika boyunca 50 santigrat derecede 50 derece SDS 300 mikrolitre pelet eritin.
Son olarak, 10 dakika boyunca 17 santigrat derece 13, 500 g tüp santrifüj. Ve protein içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Nicel ters transkripsiyon PCR gerçekleştirmek için.
İlk olarak, ters transkripsiyon ile cDNA hazırlamak için izole RNA bir nanogram kullanın. CDNA bir stok plaka yapmak için, 96 kuyu plaka bireysel kuyulara her cDNA örnek 100 mikrolitre ila 100 seyreltme ekleyin, su sadece kuyular ve seri seyreltilmiş numuneler gibi uygun kontrolleri içerir, her gen için astar verimliliği kurmak için. Astar her set için bir ana karışımı yapmak için, su yedi mikrolitre kadar ekleyin, bir DNA-intercalating siyanür boya, ve beş mikro-molar her ileri ve ters astar.
Bir RT-qPCR plakauygun kuyulara ana karışımı yedi mikrolitre ekleyin. Daha sonra, stok plakasından cDNA'nın üç mikrolitresini ekleyin ve kullanılan astarlara uygun bir RT-qPCR protokolü kullanarak plakayı çalıştırın. Rt-qPCR, RNA seq tahlilinde belirlenen hedefleri doğrulamak için üç solucan suşunun dört bağımsız örneğinden izole mRNA'ların analizi yapıldı.
F07C4.12 geni eat-2 solucanlarında her iki tahlilde de düzenlendi, ancak rsks-1 solucanlarında regülasyonu RT-qPCR testi ile tespit edilmedi. Ayrıca, RNA seq eat-2'de mrp-1 ve rsks-1 solucanlarında ekspresyon değişiklikleri RT-qPCR ile doğrulandı. Mutant solucanlarda organel marker genlerinin yükselticisi veya aşağı regülasyonu da RT-qPCR analizi ile saptandı.
GtCp ile RIPA'dan çıkarılan proteinlerin SDS sayfası ile ayrılan ve coomassie mavisi ile boyanmış solucanlarda karşılaştırılması, GTCp'den çıkarılan proteinler için daha büyük proteinlerin daha iyi çözünürlüğü ile benzer bir kalite göstermiştir. Batı leke analizi çoğu durumda benzer protein düzeyleri gösterdi;ancak, proteinler 75 kilodalton daha büyük RIPA çıkarılan protein daha düşük seviyelerde gösterdi. Üç solucan suşunun dört ayrı örneğinden alınan hedefler mRNA ve protein düzeyleri arasındaki karşılaştırma, protein düzeyinde daha fazla değişkenliğe sahip mRNA düzeylerinin düşük değişkenlik gösterdiğini göstermiştir.
DNA izolasyonu bağlamında verim, bulutlu interfaz tabakasını organik veya pembe tabakadan kurtarma yeterliliğine son derece bağlıdır. Resolubilizasyon tampon hacmini artırarak veya SDS yanında diğer deterjanlar ekleyerek pelet proteinlerin çözünürhale artırmak için gerekli olabilir. Bu yöntemin kullanılması, mRNA'nın proteine çevrilmesi ile eşakraba olmayan durumların doğru bir şekilde belirlenmesine yardımcı olabilir ve çeşitli koşullar altında transkripsiyon sonrası ve çeviri sonrası düzenleyici mekanizmaların daha derin araştırılmasına yol açabilir.
Laboratuarımızda, bu protokol değerli ve sınırlı süreli çekirdek örneklerini korumak için kullanılmıştır. Ayrıca, bu sirkadiyen ritim alanında benimsemek için yararlı bir protokol olacağını hayal edebiliyorum. RNA izolasyonunda kullanılan GCTP reaktifi ve çözücüler tehlikelerdir ve dikkatli kullanılmalıdır.
