Membran ve hücre duvarı seçici floresan boyalar organel dinamiği ve yaşayan mantar hücrelerinin analizi için önemli araçlardır. Protokollerimiz, bu boyaların seçiminin gerçekten hayati lekeler olarak uygulanması için temel teorik arka plan ve pratik kılavuzlar sağlamaktadır. Bunun için önemli nokta hala yüksek kaliteli, uzun vadeli canlı hücre görüntüleme için gürültü oranları için iyi sinyal sağlarken doygunluk veya boya toksisitesi ile ilgili hücresel eserler neden olmayan çok düşük boya konsantrasyonları kullanmaktır.
Tıp Üniversitesi Nükleer Tıp Bölümü'nden meslektaşlarımızla, yakın zamanda bu boyama tekniklerini kullanarak aapergillosis'in görüntü güdümlü tanısı için yeni bir yaklaşım geliştirdik. Membran ve hücre duvarı yapılarını gerçek zamanlı olarak izleyebilme yeteneği, deneysel ilaç bileşiğinin alım dinamiklerini belirlemek için çok önemliydi. Bu prosedüre başlamak için, öncelikle hazırlanmış bir önkültür edinin.
Prekültür koloni kenarından sporlaşmayan misel taşı taşıyan küçük bir agar bloğunu kesmek için steril bir neşter kullanın. Deneysel kültürü aşılamak için agar bloğunu taze, katı bir orta plakanın ortasına yerleştirin. Kuluçkaya yatılması amaçlanan gelişim aşamasına göre deneysel kültürü kuluçkaya yatırın.
Örnek hazırlama biraz hassas ve görüntü edinme ayarları optimizasyonu oldukça karmaşıktır. Sözlü açıklama eşliğinde her iki yordamın görsel gösterimi büyük ölçüde çoğaltılamazlığı kolaylaştırır. Numuneleri monte etmek için, temiz bir 24 by 60 milimetrecam kapak kayma hazır tutmak ve merkezi üzerine sıvı minimal orta veya fizyolojik tuz çözeltisi 18 mikrolitre ekleyin.
Hazırlanan 20 mikromografi boyasının iki mikrolitresini kapak kayar ortasındaki sıvıya ekleyin ve hava kabarcıklarının üretimini önlerken birkaç kez yukarı ve aşağı borular atarak iyice karıştırın. Temiz bir neşter kullanarak, koloninin çevresinden 15 ila 15 milimetrelik bir numune kesip kapak kapağındaki orta damlanın yanına dikey olarak yerleştirin. Bloğun üst kenarını ve bloğun arka tarafını yerinde tutmak için parmağınızı desteklemek için neşter kullanın.
Daha sonra miselyumu sıvının üzerine taşıyan tarafı yavaşça indirin. Hazırlanan örneği mikroskop aşamasına monte edin. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi tek tek hyphae ayakta dinamikleri yakalamak için temel görüntü edinme ayarlarını ayarlayın.
Endositoz alımı tahlilleri için, mikroskopi sisteminde bulunan FM 143 veya FM 464 için en iyi uyarma ve emisyon ayarlarını belirlemek ve sistemdeki bu ayarları buna göre ayarlamak için şekil 1'e ve metin protokolünden birine başvurun. Önceden ayarlanmış ayarları kullanarak görüntü kaydına başlayın ve sonuçları değerlendirin. Daha sonra, denemenin odaklandığı plazma zarı veya endositon dinamiği nin yönünü yakalamak için gereken mekansal ve zamansal çözünürlüğe görüntü kazanım ayarlarını optimize edin.
Hücre duvarı dinamiği için, uygulanan hücre duvar boyası için en iyi uyarma ve emisyon ayarlarını belirlemek ve mikroskopi sistemindeki ayarları buna göre ayarlamak için şekil 4 ve tablo bir metin protokolüne başvurun. Önceden ayarlanmış ayarları kullanarak görüntü kaydına başlayın ve sonuçları değerlendirin. Daha sonra, denemenin odaklandığı hücre duvarı morfogenezinin yönünü yakalamak için gereken mekansal ve zamansal çözünürlüğe görüntü edinme ayarlarını optimize edin.
Sadece hücresel süreçleri görselleştirmenin yanı sıra, canlı hücre görüntüleme kaydedilen verilerden nicel bilgilerin çıkarılmasını sağlar. FM 464 alım testlerinin bir örneğinde, mantar örnekleri koloni olarak yetiştirilir ve ters agar blok yöntemi ile monte edilir. Tahliller gen delemesi ve gen aşırı trichoderma atroviride mantar spesifik protein SFP 2 mutantlar aşırı ifade endositoz in spatio-temporal organizasyon kusurları tespit.
Endositik kompartmanlara yönelik floresan füzyon proteinlerinin FM 464 birlikte boyama örnekleri burada gösterilmiştir. Bu co-boyama iki gelişmiş yeşil floresan protein transmembran proteinleretiketli hücre altı dağılımı ile ilgili istihdam edilir, SFP 2 ve GPR 1, trichoderma atroviride endositik yol. Morphogenetik farklılıkların belirlenmesi için FM 464 ortak boyama bir örnek bu co-boyama unescently etiketli BUD-6 polarizm karmaşık protein subsellüler lokalizasyon dinamikleri daha fazla ilişki sağlar septa ve polarize hipüf ucu büyüme oluşumu gibi bazı insan ticaretine bağlı süreçlerin sonuna kadar gösterir.
Ayrıca nörospora crassa vahşi tip ve mutant suşları arasında hücre altı organizasyon ve hiphal mimarisi farklılıkları karakterize eder. Temsili hücre duvarı boyama gösteriyor ki calcofluor beyaz farklı etkileşim özellikleri, solofenil flavine, ve hücre duvarı polimerleri ile kongo kırmızısı delta SFP 2 mutant ve trichoderma atroviride vahşi türü arasındaki morfogenetik farklılıkları vurgulamak. Yüksek boya konsantrasyonları tarafından neden hücre duvarı stresinin artırılması daha hızlı oluşur ve vahşi türüne göre mutant daha belirgindir.
Buna ek olarak, aynı görüntüler her iki suş arasında hiphal çapı ve septal mesafe ile ilgili morfogenetik farklılıkların nicelleştirilmesi için izin verir. Hücre duvarı biyosentezinin gerçek zamanlı olarak izlenmesi, çok düşük kalkoflor beyaz konsantrasyonunun hücre duvarının boya molekülleri ile doygunlaşmasını engellediğini ve hücre duvarı biyosentezinin kantitatif gerçek zamanlı izlenmesine olanak sağladığını gösterir. Bu yeni hücre duvar materyalinin birikimi tek düze olmadığını ortaya koymaktadır, ancak nörospora crassa dermalinfüzyon önce hücre-hücre eki üzerine bir hücre-hücre eki üzerine bir hücrenin göreli yerinden kaynaklanan lokalize fiziksel streslere çok hızlı yanıt verir.
Daha az daha fazladır. Floresan belirteçlerin hücresel süreçlere müdahalesini engellemek için mümkün olduğunca az boya kullanın. Bu işlemden sonra, taşıma ve biyogenez kinetik ölçmek için foto-beyazlatma deneyleri sonrası flourescence kurtarma yapılabilir.
Milenyumun başında ipliksi mantarlarda membran ve hücre duvarı boyamaöncü giriş kelimenin tam anlamıyla mantarlara bakmak şekilde devrim yaptı. Calcofluor beyaz göz tahrişlerine neden olabilir ve sınıflandırılmış bir kanserijendir. Kongo kırmızısı kanserli ve teratojeniktir, bu yüzden lütfen bu boyaları kullanırken göz ve cilt koruması takın.
