Membran- und Zellwandselektive Fluoreszenzfarbstoffe sind wichtige Werkzeuge für die Analyse der Organelle-Dynamik und lebender Pilzzellen. Unsere Protokolle bieten wesentliche theoretische Hintergründe und praktische Richtlinien für die Anwendung einer Auswahl dieser Farbstoffe als wirklich lebenswichtige Flecken. Der Schlüsselpunkt dafür ist, sehr niedrige Farbstoffkonzentrationen zu verwenden, die keine zellulären Artefakte im Zusammenhang mit Sättigung oder Farbstofftoxizität verursachen, während gleichzeitig gute Signal-Rausch-Verhältnisse für hochwertige, langfristige Live-Zell-Bildgebung zur Verfügung gestellt werden.
Mit Kollegen vom Institut für Nuklearmedizin der Medizinischen Universität haben wir vor kurzem diese Färbetechniken eingesetzt, um einen neuartigen Ansatz für die bildgesteuerte Diagnose von Aapergillose zu entwickeln. Die Fähigkeit, Membran- und Zellwandstrukturen in Echtzeit zu überwachen, war entscheidend für die Bestimmung der Aufnahmedynamik der experimentellen Wirkstoffverbindung. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie zunächst eine vorbereitete Präkultur.
Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen kleinen Agarblock zu schneiden, der nicht-sporulating Myzel vom Kolonierand der Präkultur trägt. Platzieren Sie den Agarblock in der Mitte einer frischen, festen mittelgroßen Platte, um die experimentelle Kultur zu impfen. Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem Entwicklungsstadium, das inkubiert werden soll.
Die Probenvorbereitung ist etwas heikel und die Optimierung der Bildaufnahmeeinstellungen recht komplex. Die visuelle Demonstration beider Verfahren, begleitet von einer verbalen Erklärung, erleichtert die Reproduzierlichkeit erheblich. Um die Proben zu montieren, halten Sie einen sauberen 24 mal 60 Millimeter Glasdeckel schlupf bereit und fügen Sie 18 Mikroliter flüssige minimale mittlere oder physiologische Salzlösung in die Mitte.
Fügen Sie der Flüssigkeit in der Mitte des Deckels zwei Mikroliter der vorbereiteten 20 Mikromolar-Farbstoff-Arbeitslösung hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen und gleichzeitig die Produktion von Luftblasen vermeiden. Mit einem sauberen Skalpell eine 15 mal 15 Millimeter große Probe aus der Peripherie der Kolonie herausschneiden und vertikal neben den mittleren Tropfen auf dem Deckelschlupf platzieren. Verwenden Sie das Skalpell, um die obere Kante des Blocks zu unterstützen und einen Finger, um die Rückseite des Blocks an Ort und Stelle zu halten.
Dann senken Sie langsam die Seite, die das Myzel auf die Flüssigkeit trägt. Montieren Sie die vorbereitete Probe auf die Mikroskopstufe. Passen Sie zunächst die grundlegenden Einstellungen für die Bildaufnahme an, um die stehende Dynamik in einzelnen Hyhasen zu erfassen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Für die Endozytose-Aufnahme-Assays konsultieren Sie Abbildung 1 und Tabelle eins des Textprotokolls, um die besten Anregungs- und Emissionseinstellungen für FM 143 oder FM 464 zu identifizieren, die auf dem Mikroskopiesystem verfügbar sind, und passen Sie diese Einstellungen im System entsprechend an. Starten Sie die Bildaufzeichnung mit den zuvor angepassten Einstellungen und werten Sie die Ergebnisse aus. Optimieren Sie dann die Bildaufnahmeeinstellungen auf die räumliche und zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um den Aspekt der Plasmamembran oder Endozytosedynamik zu erfassen, auf die sich das Experiment konzentriert.
Für die Zellwanddynamik konsultieren Sie Abbildung vier und Tabelle eins des Textprotokolls, um die besten Anregungs- und Emissionseinstellungen für den angewendeten Zellwandfarbstoff zu identifizieren und die Einstellungen auf dem Mikroskopiesystem entsprechend anzupassen. Starten Sie die Bildaufzeichnung mit den zuvor angepassten Einstellungen und werten Sie die Ergebnisse aus. Optimieren Sie dann die Einstellungen für die Bildaufnahme auf die räumliche und zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um den Aspekt der Zellwandmorphogenese zu erfassen, auf den sich das Experiment konzentriert.
Neben der Visualisierung zellulärer Prozesse ermöglicht die Live-Zell-Bildgebung die Extraktion quantitativer Informationen aus den aufgezeichneten Daten. In einem Beispiel der FM 464 Aufnahmetests werden Pilzproben als Kolonien kultiviert und nach der invertierten Agarblock-Methode montiert. Die Assays identifizierten Defekte in der räumlich-zeitlichen Organisation der Endozytose bei der Genlöschung und Genüberexpression von Mutanten des pilzspezifischen Proteins SFP 2 von Trichoderma-Atrovidrid.
Beispiele für fm 464 Co-Färbung von fluoreszierenden Fusionsproteinen, die auf endozytische Kompartimente ausgerichtet sind, werden hier gezeigt. Diese Co-Färbung wird verwendet, um die subzelluläre Verteilung der beiden verbesserten grünen fluoreszierenden Proteine mit Transmembranproteinen, SFP 2 und GPR 1, mit dem endozytischen Weg bei Trichoderma-Atrovidid in Verbindung zu bringen. Ein Beispiel für FM 464 Co-Färbung zur Identifizierung morphogenetischer Unterschiede zeigt, dass diese Co-Färbung eine weitere Beziehung der subzellulären Lokalisationsdynamik von mehleszierend als BUD-6 Polarismus-Komplexprotein bezeichnet, um einige handelsabhängige Prozesse wie die Bildung von Septen und polarisiertem Hyphaumspitzenwachstum zu beenden.
Es charakterisiert auch Unterschiede in der subzellulären Organisation und Hyphenarchitektur zwischen wildem Typ und mutierten Stämmen von Neurospora crassa. Repräsentative Zellwandfärbung zeigt, dass die unterschiedlichen Wechselwirkungseigenschaften von Calcofluorweiß, Solophenylflavine und Kongorot mit Zellwandpolymeren morphogenetische Unterschiede zwischen dem Delta-SFP 2-Mutanten und dem wilden Typstamm von Trichodermie-Atrovirid hervorheben. Die Erhöhung der Zellwandspannung, die durch erhöhte Farbstoffkonzentrationen verursacht wird, tritt schneller auf und ist in der Mutante im Vergleich zum Wildtyp ausgeprägter.
Darüber hinaus ermöglichen die gleichen Bilder die Quantifizierung morphogenetischer Unterschiede in Bezug auf Denkstrichdurchmesser und Septumabstand zwischen beiden Stämmen. Repräsentative Echtzeitüberwachung der Zellwandbiosynthese zeigt, dass die sehr niedrige Calcofluor-Weißkonzentration eine Sättigung der Zellwand mit Farbstoffmolekülen verhindert und eine quantitative Echtzeitüberwachung der Zellwandbiosynthese ermöglicht. Dies zeigt, dass die Ablagerung von neuem Zellwandmaterial nicht einheitlich ist, sondern sehr schnell auf lokalisierte physikalische Belastungen reagiert, die sich aus der relativen Verschiebung einer Zelle auf Zell-zu-Zell-Anhaftung vor der Dermalinfusion in Neurospora crassa ergeben.
Weniger ist mehr. Verwenden Sie so wenig Farbstoff wie möglich, um Eine Störung des Fluoreszenzmarkers mit zellulären Prozessen zu verhindern. Nach diesem Verfahren konnte die Mehleszenzerholung nach Photobleichexperimenten durchgeführt werden, um die Transport- und Biogenesekinetik zu quantifizieren.
Die bahnbrechende Einführung von Membran- und Zellwandfärbung in fadenförmigen Pilzen zu Beginn des Jahrtausends hat die Art und Weise, wie wir Pilze betrachten, buchstäblich revolutioniert. Calcofluorweiß kann Augenreizungen verursachen und ist ein klassifizierter Krebs. Kongo rot ist krebserregend und teratogen, also tragen Sie bitte Augen- und Hautschutz beim Umgang mit diesen Farbstoffen.
