멤브레인 및 세포 벽 선택적 형광 염료는 세포 역학 및 살아있는 곰팡이 세포의 분석을위한 중요한 도구입니다. 우리의 프로토콜은 진정으로 중요한 얼룩으로 이러한 염료의 선택의 적용을위한 필수 이론적 배경과 실용적인 지침을 제공합니다. 이에 대한 핵심은 포화 또는 염료 독성과 관련된 세포 유물을 유발하지 않는 매우 낮은 염료 농도를 사용하는 동시에 고품질의 장기 라이브 셀 이미징을 위한 잡음 비에 좋은 신호를 제공하는 것입니다.
의과 대학의 원자력 의학과의 동료들과 함께, 우리는 최근에 aapergillosis의 이미지 유도 진단을 위한 새로운 접근을 개발하기 위하여 이 염색 기술을 이용했습니다. 멤브레인 및 세포벽 구조를 실시간으로 모니터링하는 능력은 실험약물 화합물의 섭취 역학을 결정하는 데 결정적인 역할을 했다. 이 절차를 시작하려면 먼저 준비된 사전 배양을 가져옵니다.
멸균 메스를 사용하여 프리컬쳐의 식민지 가장자리에서 비 분화 된 균사체를 운반하는 작은 천 블록을 잘라냅니다. 한천 블록을 신선하고 견고한 중간 플레이트의 중앙에 놓아 실험 문화를 접종합니다. 배양될 개발 단계에 따라 실험 문화를 배양한다.
샘플 준비는 다소 섬세하며 이미지 수집 설정의 최적화는 다소 복잡합니다. 구두 설명과 함께 두 절차의 시각적 데모는 복제를 크게 용이하게합니다. 시료를 장착하려면 24 mm 60mm 유리 커버 슬립을 준비하고 18 마이크로리터의 액체 최소 중간 또는 생리적 소금 용액을 중앙에 추가하십시오.
준비된 20 마이크로몰러 염료 작업 용액2개를 커버 슬립 중앙의 액체에 넣고 기포 생산을 피하면서 여러 번 위아래로 피펫을 섞습니다. 깨끗한 메스를 사용하여 식민지 주변에서 15 mm 15 mm 샘플을 잘라 커버 슬립의 중간 낙하 옆에 수직으로 놓습니다. 메스를 사용하여 블록의 위쪽 가장자리를 지탱하고 손가락으로 블록의 뒤쪽을 제자리에 고정시하십시오.
그런 다음, 액체에 균사체를 운반하는 측면을 천천히 낮춥다. 준비된 샘플을 현미경 단계에 장착합니다. 먼저 기본 이미지 수집 설정을 조정하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 개별 최해에서 서 있는 역학을 캡처합니다.
내분비성 섭취 분석법의 경우, 현미경 시스템에서 사용할 수 있는 FM 143 또는 FM 464에 대한 최고의 여기 및 방출 설정을 식별하고 그에 따라 시스템에서 이러한 설정을 조정하기 위해 텍스트 프로토콜 중 하나를 그림 하나 및 표참조한다. 이전에 조정된 설정을 사용하여 이미지 녹화를 시작하고 결과를 평가합니다. 이어서, 실험에 초점을 맞춘 플라즈마 멤브레인 또는 내세포역학의 양상을 포착하는 데 필요한 공간 및 측두해상도로 이미지 획득 설정을 최적화한다.
세포벽 역학의 경우, 도면 4및 표 텍스트 프로토콜 중 하나를 참조하여 적용된 세포벽 염료에 대한 최상의 외발 및 방출 설정을 식별하고 그에 따라 현미경 시스템의 설정을 조정한다. 이전에 조정된 설정을 사용하여 이미지 녹화를 시작하고 결과를 평가합니다. 이어서, 실험에 초점을 맞춘 세포벽 의 양상을 포착하는 데 필요한 공간 및 측두해상도로 이미지 획득 설정을 최적화한다.
세포 프로세스를 시각화하는 것 외에도 라이브 셀 이미징을 통해 기록된 데이터에서 정량적 정보를 추출할 수 있습니다. FM 464 섭취 소의 예에서 곰팡이 샘플은 콜로니로 재배되고 반전 된 천막 블록 방법에 의해 장착됩니다. 이 소법은 트리코데르마 아로비라이드의 곰팡이 특정 단백질 SFP 2의 유전자 삭제 및 유전자 과잉 발현 돌연변이에 있는 내분비증의 스파티오-측두측 조직에서 결함을 확인했습니다.
내시경 구획을 대상으로 한 형광 융합 단백질의 FM 464 공동 염색의 예가 여기에 나와 있다. 이러한 공동 염색은 트리코데르마 아로비라이드의 내시경 통로에 태그된 두 개의 향상된 녹색 형광 단백질 태그된 대막 단백질, SFP 2 및 GPR 1의 세포전과 관련이 있다. 형태유전학적 차이의 식별을 위한 FM 464 공동 염색의 예는 이 공동 염색이 가루로 표지된 BUD-6 극성 복합 단백질의 세포외 국소화 역학의 추가 관계를 septa 및 편광 형질 팁 성장의 형성과 같은 일부 인신매매 의존적 과정의 끝으로 허용한다는 것을 보여준다.
그것은 또한 신경 포라 crassa의 야생 모형 및 돌연변이 긴장 사이 세포 전 조직 및 최면 건축에 있는 다름을 특징지습니다. 대표적인 세포벽 염색은 칼코플루어 화이트, 솔로페닐 플라바인, 및 세포벽 폴리머가 있는 콩고 적색의 상이한 상호작용 특성이 델타 SFP 2 돌연변이체와 트리코데르마 아로비라이드의 야생형 균주 사이의 형태학적 차이를 강조한다는 것을 보여준다. 높은 염료 농도에 의해 가해지는 세포벽 응력증가는 더 빨리 발생하고 야생 유형에 비해 돌연변이에서 더 두드러진다.
또한, 동일한 이미지는 두 균주 사이의 최면 직경 과 격막 거리에 관한 형태유전학적 차이의 정량화를 허용한다. 세포벽 생합성의 대표적인 실시간 모니터링은 매우 낮은 칼코플루어 백색 농도가 염료 분자를 가진 세포벽의 포화를 방지하고 세포벽 생합성의 정량적 실시간 모니터링을 허용한다는 것을 나타낸다. 이것은 새로운 세포벽 물질의 증착이 균일하지 않다는 것을 밝힙니다, 그러나 neurospora crassa에 있는 진피주입의 앞에 세포 대 세포 부착에 한 세포의 상대적인 변위에서 기인하는 국소적인 물리적 인 응력에 아주 급속하게 반응한다는 것을 제시합니다.
적은 것이 더 많다. 가능한 한 적은 염료를 사용하여 세포 프로세스를 사용하여 형광 마커의 간섭을 배제하십시오. 이 절차에 따라, 사진 표백 실험 후 밀가루 복구는 수송 및 생물 발생 역학을 정량화하기 위하여 수행될 수 있었습니다.
천년의 시작 부분에서 필라멘트 곰팡이에 얼룩진 막과 세포벽의 선구적인 도입은 말 그대로 우리가 곰팡이를 보는 방식에 혁명을 가했습니다. 칼코플루어 백색은 눈 자극을 일으키는 원인이 될 수 있고 분류한 암원입니다. 콩고 레드는 암과 테라토제닉이므로, 염료를 취급할 때는 눈과 피부 보호기능을 착용해 주세요.
