Protokolümüz membranbağlı pirofosfatazın aktivitesini engelleyen bileşikleri bulmak için bir araç olarak çalışır. Ve bu inhibitörleri çeşitli parazit hastalıkların tedavisinde kullanılabilir. Bu protokol enzim reaktivasyonu için gerekli yüksek fosfolipid konsantrasyonu varlığında herhangi bir girişim göstermeden uzun bir süre için ucuz ve basit istikrarlı renk üreten.
PH 6.5'te 20 milimolar M-E-S, hacim gliserol ile %3.5 hacim, iki milimolar D-T-T ve %0.05 D-D-M içeren reaktivasyon tampon çözeltisinin 10 mililitresini hazırlayın. PH 8'de 200 milimolar tris hidroklorür içeren 10 mililitre reaksiyon karıştırıcıhazırlayın. Sekiz milimolar magnezyum klorür, 333 milibün potasyum klorür ve 67 milimolar sodyum klorür.
Enzim reaktivasyonu için mililitre lipozom başına 30 miligram hazırlamak. İlk olarak, PH sekiz tris hidroklorür 20 milimolar 10 mililitre ekleyin, bir milimolar D-T-T ile 0.3 soya fasulyesi L alfa fosfatidilkolin gram. Bir dakika için bir saniye sonrası aralıklarla buz ve sonicate üzerinde lipozom koyun.
Bir dakika duraklatın ve çözüm saydam sarı olana kadar tekrarlayın. Aliquot 100 mikrolitre lipozomlar, sıvı nitrojen dondurma kıvrak ve negatif 80 santigrat derece kullanılana kadar saklayın. Enzimi yeniden etkinleştirmek için lipozom solüsyonu oda sıcaklığında eritin.
Lipozom çözeltisinin 40 mikrolitresini 22,5 mikrolitre 20%D-D-M ile karıştırın. Karışımı 55 derecede 15 dakika bekletin. Ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
Ardından, yeniden etkinleştirme arabellek çözeltisinin 36,5 mikrolitresini ekleyin. Mix. Ve mililitre başına 0.13 miligram toplam konsantrasyon yapmak için konsantre protein bir mikrolitre ekleyin. Daha sonra, reaksiyon karışımının 1480 mikrolitresine yeniden aktive enzimin 20 mikrolitresini aktarın.
Yavaşça karıştırın ve hemen kullanın. İlk olarak, 200 mikrolitre de 50 milimolar stok çözümleri yapmak için D-M-S-O bileşikleri çözün. Çözünür bileşikler için iki, 10 ve 100 mikromolar vermek için, mikro tüpler de bir mililitre su ile stok çözeltisi seyreltmek.
Her seyreltme için, uygun karıştırma için bileşik çözelti girdap. Bundan sonra, bileşik ayrışma için kontrol edin ve çok kanallı bir pipet kullanarak, 96-iyi plaka her kuyuiçine reaksiyon karışımı 75 mikrolitre dağıtmak. Trilicate kontrol olarak her bileşik ve su 75 mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı beş kez pipetleme tarafından karıştırın.
Bir mikroplaka nephelometre kullanarak 300 volt her iyi ölçün. Arsenit sitrat çözeltisi hazırlamak için, ağırlık beş gram sodyum arsenit ve trisodyum sitrat dihidrat beş gram, su 100 mililitre içine her iki bileşikleri çözün. Sonra, buzul asetik asit beş mililitre ekleyin.
Karıştırın ve 250 mililitre su ekleyin, ışıktan korunan oda sıcaklığında saklayın. Daha sonra, askorbik asit 0,3 gram askorbik asit 10 milimetre buz soğuk 0,5 molar hidroklorik asit ekleyerek çözelti a. 70 miligram amonyum tetrathiomolybdate tetrahidrat ve çözünmek için girdap bir mililitre buz gibi su ekleyerek b çözeltisini hazırlayın.
A ve B çözeltilerini buzüzerinde saklayın. Fosfat standardını kalibrasyon için sıfır, 62.5, 250 ve 500 mikromolar konsantrasyonu ile hazırlamak. Reaksiyon karışımının 370 mikrolitresini içeren dört mikro tüpe sıfır mikrolitre, 12,5 mikrolitre, 50 mikrolitre ve 100 mikrolitre 5 milimolar disodyum fosfat dihidrat ekleyin.
Su ile bir mililitre kadar top. Şimdi 10 mililitre çözelti A'ya bir mililitre B çözeltisi ekleyin, elle karıştırın ve çözeltiyi buz üzerinde saklayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, tüp komut larına 40 mikrolitre sıfır, 62,5, 250 ve 500 mikromolar fosfat standardı ekleyin.
Daha sonra 25 mikrolitre bileşik çözelti ve 15 mikrolitre M-P-P-A çözeltisi karışımı ekleyin. Fosfat standardı içeren tüpler hariç. Boru şeritlerini yapışkan sızdırmazlık levhasıyla kapatın.
Her tüp şerit ayırmak için sızdırmazlık levha kesin. Sonra, numuneyi 71 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Her şerit arasında 20 saniye aralıklarla ısıtma bloğu üzerinde örnek yerleştirin.
Her şerit için yapışkan sızdırmazlığı açın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, iki molar sodyum pirofosfat dibasic 100 mikrolitre ekleyin. Ve beş kez yukarı ve aşağı borular karıştırarak.
Aynı sızdırmazlığı kullanarak tüp şeridini tekrar kapatın. Tekrar 71 derecede 5 dakika kuluçkaya yat. Bundan sonra, her şerit arasında 20 saniye lik aralıklarla numuneleri soğutma aparatı üzerine yerleştirin.
Onları beş dakika soğumasını bekleyin ve sonra sızdırmazlık levha altında su damlaları decant için kısa bir süre her şerit santrifüj. Şerit geri soğutma aparatı koyun, sızdırmazlık çıkarın ve onları başka bir beş dakika soğumaya bırakın. Daha sonra 60 mikrolitre a ve b çözeltisi ekleyin, beş kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın ve soğutma cihazındaki tüp şeritlerini 10 dakika daha tutun.
Bir duman kaputunda, arsenit sitrat çözeltisi 90 mikrolitre ekleyin ve en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun. Kararlı bir mavi renk üretmek için. Her reaksiyon karışımından 180 mikrolitreyi 96 kuyulu polistiren mikroplakaya dağıtın.
860 nanometre de her kuyunun emiciliğini ölçmek için bir mikroplaka spektrofotometre kullanın. Bu protokolde, sekiz bileşikler i-D-P ile birlikte test edildi, pozitif kontrol olarak piro fosfataz ortak bir inhibitörü. Çözelti A ve B eklenmesinden sonra, ve arsenit sitrat, oda sıcaklığında kuluçka 30 dakika içinde mavi bir renk.
İnhibe etmeyen bileşiklerin her üç konsantrasyonu da aynı mavi renk yoğunluğunu göstermiştir. E-1'den E-3'e kadar herhangi bir inhibitör olmadan. Her test bileşiğin konsantrasyonuna karşı enzimatik aktivitenin arsa, inhibisyon aktivitesi ile bileşik doğrusal olmayan bir eğri uydurma oluşturduğunu gösterir.
Pozitif kontrol olarak I-D-P'nin çizimi, yüksek konsantrasyonlarda aktivitede bir azalma olduğunu açıkça göstermektedir. Bileşikler bir, beş, altı, yedi ve sekiz için inhibisyon eğrisi. Sırasıyla 1.7 mikromolar, 21.4 mikromolar, 58.8 mikromolar, 239.0 mikromolar ve 500'den fazla mikromolar olarak yarım maksimal inhibitör konsantrasyonları gösterir.
Hazırlamayı unutmayın, M-P-P-A çözümü. Tayın başlamasından hemen önce.
