Protokolümüz, ve domuzlardan böbrek özlerinin kullanımının böbrek fizyolojisi çalışması için mükemmel ve ekonomik bir kaynak olduğunu, özellikle vasküler endotel büyüme faktörü ile diğer analitler arasındaki ilişkiyi incelediğini gözlemlemaktadır. Organ anjiyogenezinde önemli bir büyüme faktörü olan VEGF'yi diğer proteinlerle ilişkilendirmek her zaman zor olmuştur. Bu teknik, VEGF ve hormonlar gibi analitler arasındaki ilişkiyi incelememizi sağlar.
Bu kesinlikle bu önemli büyüme faktörü ile ilgili bilgi tabanımızı ilerletecektir. Bu yöntem, bu videoda belirtilenlerin yanı sıra böbrek kortikal özleri diğer analitler korelasyon için yararlı olabilir. Görsel gösteri, başkalarının herhangi bir örnekleme hatası olmadan tekrarlanabilir sonuçlar elde etmelerine yardımcı olur.
Taze doku kullanımı bu tekniğin başarısı için gereklidir. Bir hayvandan kesildikten hemen sonra taze böbrekler elde etmek önemlidir. Her zaman dokuyu buz üzerinde laboratuvara aktarın.
Böbrekleri incelemek ve gerekli doku kısmını çıkarmak için steril makas, çalgılar, bıçak ve Petri kapları kullanın. Yavaşça sagittal düzlem boyunca böbreği ikiye kesti ve böbrek merkezinde korteks bölgesinden doku parçası kesti. Bıçakla küçük parçalar halinde doku kıyma ve buz soğuk 1X RIPA lysis çıkarma tampon bir mililitre ile bir mikrofuge tüp içine aktarın.
Tüpü belirli örnek detaylarıyla etiketlendirin ve buzüzerine yerleştirin. Hiçbir parça görünür kadar bir ila iki dakika boyunca doku homojenize için steril bir prob ile bir el homogenizer kullanın, sonra hemen tüp santrifüj 9, 600 kez g dört derece santigrat beş dakika için. Santrifüjden sonra, birden fazla donma/çözülme döngüsünden kaçınmak için elisa ve toplam protein analizi için numunenin ayrı aliquot'larını hazırlayın.
Tayına başlamadan önce, tüm reaktifleri ve ar-bası plakasını oda sıcaklığına getirin ve fazla kuyuları sökün ve daha fazla kullanıma kadar dört santigrat derecede saklayın. 20X yıkama tamponu çift distile su ile 300 mililitre seyreltin ve herhangi bir çözüm olmadan boş kuyular kurmak. Standart veya örnek 50 mikrolitre ve horseradish peroksidaz başka 50 mikrolitre her kuyuya eşleşin, sonra hemen her kuyuya antikor çözeltisi 50 mikrolitre ekleyin ve plaka mühür.
Tabağı karıştırın ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her bir kuyuyu 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. Her kuyuya 50 mikrolitre a ve substrat B ekleyin, yan lara dokunarak plakayı hafifçe karıştırın, sonra 37 santigrat derecede 15 dakika karanlıkta kapatın ve kuluçkaya yatırın.
Her kuyuya 50 mikrolitre dur çözeltisi ekleyin. Yavaşça plaka dokunun ve bir spektrofotometre ile 450 nanometre de emici okuyun. Reaktifleri hazırlayın ve daha önce açıklandığı gibi tampon ukayın, sonra her kuyuya 100 mikrolitre standart veya numune ekleyin, plakayı kapatın, iyice karıştırın ve 37 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın.
Her kuyudaki sıvıyı çıkarın ve 100 mikrolitre algılama reaktifi A.Seal plakayı ekleyin ve bir saat daha kuluçkaya yatırın. Daha sonra, her kuyuyu 400 mikrolitre yıkama tamponu yla yıkayın, ardından her kuyuya 90 mikrolitre substrat çözeltisi ekleyin, tabağa hafifçe dokunun ve 37 santigrat derecede bir saat daha kuluçkaya yatırın. Son kuluçkadan sonra, her kuyuya 50 mikrolitre dur çözeltisi ekleyin, plakaya hafifçe dokunun ve spektrofotometre ile 450 nanometrede emiciliği okuyun.
Standart bir BSA tahsini ile büyükbaş ve domuz böbrek özlerinin toplam proteinini tahmin edin ve bu tahmini LH ve VEGF-A-ELISA sonuçlarını normalleştirmek için kullanın. LH ve VEGF ortalama ve ortanca düzeyleri hem hayvanlar hem de cinsiyetler için hesaplandı. Verilerin normalliği doğrulandıktan sonra LH ve VEGF arasındaki ilişkiyi incelemek için doğrusal regresyon modelleri kullanılmıştır.
LH hem büyükbaş hem de domuz böbreklerinde VEGF'nin güçlü ve önemli bir belirleyicisi olarak bulunmuştur. Bu prosedürü denerken, her dokuda aynı alanları örneklemek için hatırlamak önemlidir. Benzer bir prosedür doku her türlü ayıklamak için kullanılabilir.
Kullandığınız doku her türlü doku toplam protein ekstresi ile analitleri normalleştirmek için unutmayın.
