Protokolümüz önemli çünkü araştırmacıların bir organizmanın dışındaki koroner anjiyogenezin moleküler mekanizmasını araştırmalarına olanak sağlıyor. Bu tekniğin en büyük avantajı, bir organizmanın içindeki koroner anjiyogenez sürecini doğru bir şekilde modelleyerek koroner anjiyogenez mekanizmalarının incelenmesini kolaylaştırıyor olmasıdır. Embriyonik gün taşıyan hamile bir fare püskürtme ile başlayın 11.5 embriyolar ile 70%etanol.
Forseps ile karın üzerinde deri kaldırma, rahim boynuzu ortaya çıkarmak için bir karın deri ve periton insizyonu yanal ve anteriora kadar diyafram yapmak için makas kullanın. Rahmi kavrayarak, dokuyu serbest bırakıp rahim boynuzunu çıkar. Bir stereo mikroskop altında buz gibi steril PBS içine embriyoların dize yerleştirin ve rahim kas soyma, sarısı kese, ve her embriyo amnion kapağı.
Her embriyo izole olarak, buz üzerinde steril PBS içeren yeni bir Petri kabına dokuları aktarmak için delikli bir kaşık kullanın. Embriyonik kalp dokusunu hasat etmek için, mikroskop altında yeni bir Petri kabına kesilecek ilk embriyoyu transfer edin ve embriyoyu ventral tarafa yerleştirin. Göğüste küçük bir kesi yapmak için ince forceps kullanın, diyafram biraz üzerinde, ve kesi büyütmek için kesi içine kapalı çifekler ekleyin.
Kalp ve akciğerleri ortaya çıkarmak için göğüs duvarını açık tutmak için forceps kullanarak, hafifçe dorsal aort ve damar ortaya çıkarmak için kalbi anteriorly 90 derece hareket etmek için ikinci bir çift forceps kullanın. Sonra, kalbin tabanında bu damarları kavrayarak, dikkatle kalp ve akciğerler ön lüzuni çekin ve soğuk PBS ile dokuları durulayın. Tüm kardiyak doku hasat edildiğinde, mikroskop altında kalp örnekleri yerleştirin ve her kalpten akciğer lobları kaldırın.
Onun sırt tarafında ilk kalp Orient, ve tabanında kalp tutarak, kalpTen SV çevreleyen bitişik dokuda sol ve sağ atria kazımak için ince forseps kullanın. SV'yi izole etmek için, kalp dorsal tarafını yukarı doğru yönlendirin. SV'yi dikkatlice kalpten çıkarın ve izole edilmiş dokuyu buz üzerinde buz soğuk steril PBS içeren yeni bir altı santimetrelik Petri kabına yerleştirmek için steril bir transfer pipeti kullanın.
Tüm ventrikülleri izole etmek için, çıkış yolu kaldırmak ve buz üzerinde buz soğuk steril PBS içeren ayrı bir altı santimetre Petri kabına ventriküller yerleştirmek için yeni bir steril transfer pipet kullanın. SV ve tüm ventrikül kültürleri kurmak için, ilk kat bir sekiz mikrometre gözenek PET kültür membranlar 24 iyi kültür plaka sıcağı başına, taze seyreltilmiş ekstrasellüler matriks 100 mikrolitre ile kültür başına en az 30 dakika 37 santigrat derece. Matris katılaşmış olduğunda, her kesici uç üzerine bir ekstrüzyon aktarmak için bir transfer pipet kullanın ve mikroskop altında plaka hareket ettirin.
Temiz pratisyenler kullanarak, eksmeleri yan duvarlara bağlı olmadığından emin olmak için her kesici ucun ortasına yerleştirin ve ekstra PBS'yi dikkatlice çıkarın. Daha sonra, bir laminar akış doku kültür başlığı altında kapak kapalı plaka aktarın ve her eklemek için önceden ısıtılmış komple orta 100 mikrolitre ekleyin ve 200 mikrolitre her eklemek altında çok. Daha sonra kullanılmayan kuyulara 300 mikrolitre PBS ekleyin ve plakayı beş gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Kültürün ikinci gününde VEGF-A tedavisi için, her kültürün her iki odasından orta çıkarın ve her eklemek için PBS 100 mikrolitre ekleyin ve her kuyuya 200 mikrolitre PBS. Plakabirkaç kez döndükten sonra, kültürleri başlatmak için% 1 fetal sığır serumu ile takviye bazal orta 300 mikrolitre ile PBS değiştirin, ve kuvöz plaka dönmek. Açlıktan sonraki üçüncü günde, kontrol kuyularına 300 mikrolitre taze bazal orta artı serum ekleyin ve bazal ortam ait 50 nanogramı ve vegf-A'nın mililitresi başına tedavi kuyularına ekleyin ve plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.
Kültürün altıncı gününde, gösterildiği gibi PBS ile odaları yıkayın ve her kuyuda % 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ve her kesici uçta 100 mikrolitre fiksatif ile kültürleri düzeltin. Sallanan 4 derece santigrat ile 20 dakika sonra, oda sıcaklığında sallanan yıkama başına 10 dakika pbs 300 mikrolitre ile kültürleri yıkayın. Son yıkamadan sonra, kuyulara 300 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin ve sallanan dört santigrat derecede bir gecede kültür için ekler.
Ertesi sabah, kültürleri PBS'de iyonik olmayan yüzey aktif maddede 10 kez yıkayın, yıkama solüsyonunu her 10 dakikada bir değiştirerek kültürleri 300 mikrolitre uygun bir florofor konjuge ikincil antikor ile etiketlemeden önce bir gecede dört derece santigrat derece ile sallantıda. Ertesi gün, gösterildiği gibi non-iyonik yüzey aktif ile taze PBS kültürleri 10 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, membranı her kesici uçtan dikkatlice soymak ve membranları tek tek cam mikroskop slaytlarına yerleştirmek için ince prökler kullanın.
Numuneleri DAPI takviyeli montaj ortamıyla kaplayın ve kapak fişlerinin kenarlarını açık ojeile kapatın. Oje kuruduğunda, confokal mikroskopi ile slaytlar görüntü. İlk SV hücreleri kalp ventrikülüzerine büyüdükçe, Coup-TF2 gibi venöz belirteçler üretmeyi bırakırlar.
Kültür beş gün sonra, SV endotel hücreleri filizlenir ve membran üzerine göç. Embriyonik kalpte olduğu gibi, kaplar SV'den uzaklaştıkça Coup-TF2 ifadesi azalır. VEGF-A ile uyarılan kültürler, hem yoğunluk hem de uzunluk olarak anjiyojenik filizlerin arttığını göstermektedir. VEGF-A tarafından uyarılan diğer SV kültürleri, kontrollere kıyasla filiz uzunluğunun neredeyse üç kat arttığını göstererek, SV ve enddokardyumdan gelen endotel filizlerinin VEGF-A'ya yanıt verdiğini düşündürmektedir.
Kalp ve akciğerleri çekerken, atria çıkarırken ve SV'yi çevreleyen komşu dokuyu temizlerken SV dokusunu kaybetmemek önemlidir. Koroner anjiyogenezi görselleştirmek ve süreç boyunca hücresel ve moleküler dinamiğin ayrıntılarını yakalamak için canlı görüntüleme deneyleri yapılabilir. Bu teknik koroner anjiyogenezin potansiyel moleküler mekanizmalarının değerlendirilmesinde ve genel olarak anjiyogenezin incelenmesinde model bir sistem olarak son derece yararlıdır.
