Biz grafik çalışması için Kristin Johnson teşekkür ederim.

Hayvanları ile ilgili tüm protokoller sunulan ve onaylanan Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından Boston Çocuk Hastanesi de ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tavsiyelerine uygun olarak yürütülmektedir edilir. Prosedürü gerçekleştirirken, steril aletleri ve aseptik techniqure kullandığınızdan emin olun. Topakların hazırlanması 1. <ol><li> Sukralfat, 10 mg ve steril bir spatula ile bükülmemiş Hydron, 60 mg tartılır. Ayrı mikrosantrifüj tüpler yerleştirin. </li><li> Steril bir 10 cm&#39;lik bir tabak içine örgü bir 1 cm kare parça yerleştirin. Çok sığ kapağındaki artıklarını örgü ters. Kenara koyun. </li><li> En az 10 dakika boyunca Hydron ve vorteks etanol 500 ul ilave edin. </li><li> Kısaca, sukralfat ve vorteks: büyüme faktörü (bFGF için 20 ug, 50 ug, VEGF için standart) uygun miktarda ekleyin. Bir saklayın büyüme faktörü1 mg / ml bir konsantrasyonda, -80 ° C dondurucu. Eklenen sıvı hacmi tam olarak nemlendirilir sukralfat sağlamak için 20 ul bir en az 50 olmalıdır, ancak ul geçmemelidir. Daha büyük bir hacim, bir sonraki aşamada sıvının buharlaşma zorlaştırır. </li><li> Karışım tamamen kuruyana kadar kullanılan sıvı hacmine bağlı olarak, normalde 30-50 dakika, düşük ayarlı santrifüj evaporatör içine sükralfat karışımı yerleştirin. <ol><li> Steril bir spatula ucu ile konik bakiye nem için karışımın edin. Karışım &quot;gevrek&quot; hissetmeniz gerekir. </li></ol></li><li> Tüp içindeki sükralfat karışımı parçalamak için bir spatula konik ucu kullanın. </li><li> Sukralfata Hydron 10 ul. <ol><li> Nedeniyle Hydron viskoz olması nedeniyle, 200 ul, pipet ucu ucu kesin ve çekip tekrar pipetleme sukralfata eklemeden önce 10 ul bırakın. </li></ol></li><li> Çabuk bükülmüş tükürdü kullanınula Hydron ve sakralfatın karıştırın ve tüp kaldırmak. <ol><li> Bükülmüş spatula ucu alt tarafı boyunca karışımın toplanması ve tüpün duvarı boyunca spatula dışarı çekilmesi, sonra, tüp döndürün. Bu adımı verimli yapılmalıdır böylece karışım hızlı bir şekilde kurur. </li></ol></li><li> Yerinde tutmak için forseps kullanarak hazırlanan örgü üzerine karışımı sürün. Karışım, düz bir katman olabilir ve örgü deliklere doldurmalıdır. </li><li> Tüp içeren Hydron içine bükülmüş spatula daldırın ve mesh o kaplamaz her iki tarafını kullanın. </li><li> Çanak tarafındaki kenarına doğru eğilerek kaplanmış örgü yerleştirilir ve 30-45 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakılır. </li><li> -20 ° C derin dondurucuda örgü yerleştirin veya bir sonraki adıma hemen devam. Çanak içinde örgü tutun. </li><li> Daha büyük bir petri, kapak kapalı içinde 35 mm tabak yerleştirin. Dikkatli dışında 35 mm çanak üzerinde mesh lifleri çekmek için forseps çifti kullanın. Kaçak topakları cbir ucunda daha büyük bir çanak toplanabilir. <ol><li> Kapsamında düzgünlüğü için pelet edin. Böylece yöntem, bFGF için pelet başına standart bir doz yaklaşık 250 pelet elde edilir ve VEGF, sırasıyla 80 ng ve 200 ng vardır. </li></ol></li><li> En fazla 3 ay boyunca -20 ° C dondurucu içinde 35 mm çanak saklayın peletler. </li></ol> PELETİ 2. Cerrahi implantasyonu <ol><li> Işletim mikroskop altında ameliyat alanını ayarlayın. </li><li> Avertin (400-500 mg / kg, karın içinden) ile anestezi fare ve benzeri gözünün mikroskop altında fare yerleştirin. Anestezi yeterli düzeyde sağlamak için parmak tutam gerçekleştirin. </li><li> Küresi üstüne proparakain çözeltisi 1 damla yerleştirerek fare göz anestezisi. 20-30 saniye bekleyin ve bir gazlı bezle hafifçe sürün. </li><li> Körleşmiş # ile forseps ve göz arasındaki cildinizi belli olan 1 kuyumcular forseps fare göz Proptose. Bu doğru uygulanan basıncın hüküm önemlidir.60; Çok sıkı bir şekilde göz Holding de göz ameliyatı sırasında hareket sağlayacak bir tutuş gevşek ederken, kırmızı ve tahriş olmasına neden olacaktır. </li><li> Kornea içine limbustan yaklaşık 1 mm bir kesi yapmak için 30 ° microknife kullanın. Kesi uzunluğu 1-2 mm olmalıdır. İnsizyon midstroma epitel tabakasının içine penetre kadar derin ama göz yırtmak için derin olmayan olmalıdır. </li><li> Kesi dik bir cebi yapmak için von Graef bıçak kullanın. <ol><li> Kesi yerinde kornea tabakasının altında bıçak kaydırın ve hafifçe bıçak çalışmak ve böylece cebi oluşturan, boşluk büyütmek için kesi boyunca hareket ettirin. Bu gözün kavis çalışmak mümkün de fare taşımak için yardımcı olur. Göz rupturing önlemek için ucu ile aşağı itmek için değil dikkatli olun. </li></ol></li><li> Proparakain ile # 5 kuyumcuya forseps ıslatın ve yemeğin dışında bir pelet pick up. Göze bir pelet yerleştirin. </li&gt; <li> Proparakain ile von Graef bıçağı ıslatın ve lastik ve esnek yapmak için pelet üzerine sıvı bazı aktarın. Gazlı bez ya da pamuklu bir bez ile fazla nemi alınız. </li><li> Kornea tabakası altında içine itmeye von Graef bıçak kullanarak cebine pelet yerleştirin. Pelet içindeki sonra, topak güvenli olduğunu kontrol etmek için site üzerinde von Graef bıçağın düz tarafı çalıştırın. </li><li> Coat üçlü antibiyotik merhem ile göz. </li><li> Üzerinde fareyi ters çevirin ve zıt göz ameliyatı tekrarlayın. </li></ol> Korneal neovaskularizasyon 3. miktarının belirlenmesi. Zaman belirli bir süre boyunca gemileri geliştirmek için hayvanları bırakın. Damar derecelendirilmesi gün kullanılan büyüme faktörüne bağlıdır. Sınıf bFGF 6. günde 5 gün ve daha zayıf VEGF implantasyonu günü günde 0&#39;dır. <ol><li> Avertin ile fare (400-500 mg / kg, karın içinden) anestezisi. </li><li> Gra için yarık lamba mikroskop kullanımıding. Bir göz damarları filizlenmiş var gözün çevresine damar uzunluğu ve mesafe ölçmek için bir ölçüm aygıtı olarak kullanılan mercek içinde bir el çantası, çizgiler vardır. <ol><li> Çok göz doğrudan öncesinde pelet ile göz görülür fare konumlandırma, kapsam önünde fareyi tutun. Cilt yüzünde sıkılır ve göz hafifçe proptosed böylece başparmak ve işaret parmağı arasında başını stabilize. </li></ol></li><li> Limbal damar boyunca doğrudan pelet altında çantası y-eksenini yerleştirin. Pellet doğru yukarıya damarların dallanma uzunluğunu ölçer. Milimetrenin onda bu ölçümü kaydedin ve damar uzunluğu (VL) (Şekil 1A) belirler. </li><li> Bu gemiler filizlenmiş olduğunu göz çevresinde mesafenin açık olur, böylece fareyi veya retiküle ya çevirin. Bu 12. Belirlediğiniz bu sayı saat saat (CH) (Şekil 1 ile 1 aralıklarla bir saat yüz olarak göze düşünmek en kolayB). Bu bir tam sayı veya 0.25 (örn, 2, 2.25, 2.5 veya 2.75) fraksiyonları olabilir. Not: CH özneldir. Örneğin, bazıları damar uzunluğu yarım maksimal olduğu noktada ölçüm durabilir limbustan filizlenmiş tüm damarlarını içerdiği göz çevresinde mesafeyi ölçmek olabilir. Önemli faktör, bir sınıf seçer nasıl tutarlı olmaktır. </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> Neovaskularizasyonu Şekil 1. Kantitasyonu. (A) 80 ng bFGF&#39;dir pelet C57BL / 6J fare damar uzunluğunu ölçmek odaklı biomikroskop retiküle gösteren takılmıştı. VL = 0.9 mm. (B) Aynı göz gösteren biomikroskop reticule saat saat ölçmek için döndürülebilir. CH = 3.25. Hesaplanan damar alan = 1.84 mm2. Bu görüntüler dijital çantası şematik eklenmesi için izin vermek için geliştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <ol start="5"><li> Bir oval alanda dayanmaktadır aşağıdaki formül kullanılarak damar alanını (VA), hesaplayın Express VA kare milimetre (Not, bu notlandırma zaman akılda tutmak için. Yararlı). Aşağıda formülü aşağıdaki gibidir: Gemi uzunluk x Saat saat x 0,2 π = Gemi alanı </li></ol>

<ol>
	<li>Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+bovine+vascular+endothelial+cells:+fibroblast+growth+factor+as+a+survival+agent.">Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).</li><li>Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissues+contain+chemoattractants+for+vascular+endothelial+cells.">Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells.</a> Nature. 288, 483-484 (1980).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-promoting+phorbol+esters+induce+angiogenesis+in+vitro.">Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro.</a> Cell. 42, 469-477 (1985).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).</li><li>Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+angiogenesis+in+vitro:+light+microscopic,+ultrastructural,+and+radioautographic+studies.">Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies.</a> In Vitro. 18, 538-549 (1982).</li><li>Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+models+of+vascular+functions.">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).</li><li>Sandison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+microscopic+study+of+living+growing+tissues+by+the+introduction+of+a+transparent+chamber+in+the+rabbit's+ear.">A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear.</a> Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).</li><li>Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+angiogenesis+assays:+progress+and+problems.">Quantitative angiogenesis assays: progress and problems.</a> Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).</li><li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay.">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).</li><li>Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+in+vivo+by+prevention+of+neovascularization.">Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization.</a> J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+growth+and+neovascularization:+an+experimental+model+using+the+rabbit+cornea.">Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea.</a> J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).</li><li>Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+heterogeneity+of+angiogenesis+in+mice.">Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice.</a> FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).</li><li>Chang, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis.">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li><li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution.">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li><li>Turner, P. V., Albassam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+rats+to+corneal+lesions+after+injectable+anesthesia.">Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia.</a> Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).</li><li>Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reversible+cataract+induced+by+xylazine+and+by+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats+and+mice.">Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice.</a> Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Başarılı bir kornea tahlilini yapmak, bazı kritik adımlar vardır. İlk implante olması ve damarların uyarabiten üniforma peletlerini yapıyor. Pelet hazırlık en önemli parçaları) taşıyıcı-serbest büyüme faktörü kullanılarak 1; 2) peletler döküm örgüye eppendorf tüpüne dikkatli bir şekilde, ancak ikinci hızla hareket eden nihai karışımı), sukralfat ve Hydron ve 3 büyüme faktörü iyi bir karışım sağlamak. O &quot;kukla&quot; topaklar tekniği uygulamak için büyüme faktörü olm...

Anjiyogenez süreci, yeni kan damarlarının oluşumu olan önceden varolan de kurulabilir, oldukça karmaşıktır ve damar filizlenme ve morfojenezinin farklı aşamaları kontrol eden endojen faktörler ile düzenlenir. Anjiyogenesis nedeniyle yanlısı ve anti-anjiyogenik faktörler arasındaki dengenin bir vardiya, normalde hareketsiz bir durumda damarsal koruyan bir denge için tetiklenir. Yetişkinlerde Anjiyogenez, kadın yumurtalık döngüsü sırasında veya yara iyileşmesi ve doku rejenerasyonu gibi tamir yöntemleriyle bazı fizyolojik koşullar altında meydana gelir. Ancak, aynı zamanda maligniteler, otoimmün hastalık ve enflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere birkaç patolojiden bir özelliğidir. Bu fizyolojik ve patolojik durumlarda angiogenesisin katılımı araştırma ve terapisi için çekici bir hedef yapan önemli bir konudur. Nedeniyle anjiyogenez karmaşıklığı ve çeşitli ce tutulumunamodelleri sınırlı kalması ve eşsiz bir mikro-ortam, in vivo özetlemek olamaz in vitro endotel hücreleri, perisitler, destek hücreler ve stromal dolaşımdaki hücreleri de dahil olmak üzere bu süreçte ve LLS etkenler. Angiogenesis in vitro tahlilleri ana ölçüde endotel hücreleri üzerinde doğrudan etkilerinin gözlenmesi ve kontrollü koşullar altında anjiyojenik işleminde bazı adımlar ölçme üzerine odaklanmıştır. Bu deneyler 1, endotel hücre çoğalmasının, göç 2, 3 ağı oluşumu, tüp oluşumu 4 ölçülmesini ve parçacıklarının 5 çimlenme bulunmaktadır. Ex vivo modelleri, in vitro olanlardan farklı olarak, daha karmaşık ve çoğul doku hücre tipleri dahil, bir örnek olmak aort halkası deney 6. In vivo var Yine de, diğer sistemler gibi, dolaşımdaki hücrelerin katkısını ve endotel hücrelerinin doğal dokudan yakalayamazsınız. Girişimleriçok gelişmiş olmasına rağmen, mikroakışkan sistemleri 7 kullanılarak yapılmaktadır in vivo ayarı, ancak hatta bu deneyleri taklit akış altında anjiogenezisi çalışma, halen in vivo mevcut tüm bölmelere için açıklayamazlar. Nedeniyle, in vitro ve ex vivo anjiyogenez modellerinin sınırlamalara in vivo modeller anjiyogenez çalışmaları için daha güvenilir seçimler kalır. Bu modelleri örnekleri mikroskop 8 altında büyüyen kan damarlarının görselleştirme izin şeffaf odaları, &quot;pencere&quot;, implantasyon dahil, örneğin fare kulağı ve tavuk koryoallantoik zarı gibi normal dokularda matrigel ve damar oluşumu gibi enjekte cilt altı implantları (CAM ). Bununla birlikte, en kabul edilebilir ve kantitatif in vivo anjiyogenez modellerden biri doğal avasküler kullanan burada tarif edilen korneal mikrocep neovaskularizasyon tahlili, birBir &quot;ekran&quot; olarak kornea görselleştirmek ve yeni anjiyojenik büyüme 9 değerlendirmek için. Farelerde geliştirilen Burada komea mikro-tahlili tarif eder. İlk model tavşan kornealarından spesifik olmayan anjiyojenik uyaranlara ölçmek için kullanılmıştır. Bu, tavşan gözün ön odasının sulu cismi; tümör parçaları sokulması ile yapılabilir ve tümörle tetiklenmiş neovaskülarizasyon 11 ölçülmüştür. Ancak, deney sonra daha iyi belirlemek ve anjiyojenik etkisini standardize spesifik büyüme etkilerini incelemek için 10 faktörleri gelişti. Gözdeki büyüme faktörü serbest bırakmak amacıyla, anjiogenik büyüme faktörleri, bilinen miktarlarda ihtiva eden yavaş salımlı peletler yerine dokuların kullanılmıştır. Örneğin bFGF ve VEGF gibi saflaştırılmış rekombinant anjiyojenik proteinlerin mevcudiyeti anjiyojenez module 12 belirli hedeflere olarak kullanımı gerekmektedir. Başlangıçta, tahlilidirbüyük ölçüde onların büyüklüğü nedeniyle ancak daha sonra model fareler çevrilmiş ile çalışmak daha kolay tavşanlarda, kullanılan; Bir daha küçük ve daha az pahalı hayvan modeli. Farelere tavşan kayıyor böylece anjio 13 etkileyen genetik bileşenleri içine yeni bir araştırma alanı oluşturarak, genetik manipüle hayvanları kullanmak için güçlü olmak önemli bir avantaj sağladı. Anjiyojenez okuyan kornea deneyinin daha kabul edilebilir kullanımına ek olarak, diğer biyolojik prosesler için de değiştirilebilir deneyler kullanılarak araştırılmaktadır olabilir. Örneğin, lenfanjiyogenezin çalışmalar spesifik moleküler belirteçlerin 14 ile lenfatik damarların görselleştirme izin düşük doz bFGF&#39;dir pelet implantasyonu ile mümkün yapılmıştır. Buna ek olarak, bu tahlili, angiogenesisin 15 radyasyonun etkilerini değerlendirmek için bir araç sağlamaktadır. Toplamı, korneal mikrocep denemesi anjiyojenez niceliksel, temsilcisi olduğunuroducible, in vivo anjiyogenezin esnek bir değerlendirme. Bu tahlilde önemli bir avantajı, gemilerin, doğal olarak avasküler doku üzerinde büyür, çünkü arka plan kapların ölçüm gereksiz olmasıdır. Burada ayrıntılı olarak, bu testin protokolü tarif oluşabilir ve farklı senaryolar tartışır. Deney, 3 &#39;farklı parçadan oluşur. Burada elde edilen nörovasküler büyüme ölçmek için kullanılan bir gelişme faktörü dahil topakların hazırlanmasını izleyen cerrahi implantasyon metodu ve son olarak anlatacağız.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

Fare korneal mikrocep denemesi angiogenesisi değerlendirilmesi için sağlam ve kantitatif in vivo deneydir. Doğal olarak kornea avasküler boyunca kan damarı büyümesi tetiklemek belirli büyüme faktörlerini içeren standart yavaş salimli peletleri kullanarak, anjiyojenez ölçülebilir ve hesaplanabilir. Bu deneyde, bir anjiyojenik tepki kullanılan büyüme faktörü türüne ve miktarına bağlı olarak, birkaç gün boyunca oluşturulur. Neovaskularizasyon indüksiyonu ya da genel olarak temel fıbroblast büyüme faktörü (bFGF) veya vaskular endotelyal büyüme faktörü (VEGF) tarafından tetiklenir. Sukralfat ve Hydron (poli-HEMA (poli (2-hidroksietil metakrilat))) ve peletler halinde karışımın döküm bu büyüme faktörleri birleştirerek, bu cerrahi fare gözüne implante edilebilir. Bu üniforma topaklar damar alanı q için gerekli yeterli anjiyojenik yanıt sağlayan (sırasıyla bFGF veya VEGF) beş veya altı gün boyunca büyüme faktörleri, yavaş serbest bırakınyarıklı bir lamba kullanılarak uantification. Bu deney, anjiyojenik modülatörü ilaç ya da tedavi yanı sıra, anjiyojenezi etkilemeye, farklı genetik geçmişlerde arasında karşılaştırma değerlendirme dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu testte uyguladıktan sonra bir uzman araştırmacı göz başına en az 5 dakika bir pelet naklediyorlar.

Normal düşük anjiyojenik C57BL / 6J fareler bFGF ve VEGF peletler için tipik sonuçlar, Şekil 2A ve B de gösterildiği gibi, sırasıyla. Şekil 2E, bu büyüme değişen dozları ile C57BL / 6J suş içerisinde damar alanının normal dağılımı (VA) görülmektedir faktörler. 1,8-2,4 mm2 aralığında değerler kabul edilebilir olsa da 80 ng bFGF topaklar normal olarak yaklaşık 2.0 mm2 bir VA neden olur. 200 ng VEGF k?...

Watch this Scientific Journal Video about The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye at JoVE.com

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Protokol farelerde geliştirilen komea mikro-tahlili tarif eder.

Kornea mikrocep Testi: Fare Eye Angiogenezis Bir Model

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

the-corneal-micropocket-assay-a-model-of-angiogenesis-in-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Görüntüleme.  Boston Children's Hospital.  Protokol farelerde geliştirilen komea mikro-tahlili tarif eder. 

Video: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Nörobilim

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Retina Ganglion Hücre Survival Eğitim Bir Optik Sinir Crush Yaralanma murin Modeli

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Nöritik plaklar Alzheimer Hastalığı Fare Modeli Algılama

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Test Görsel Fonksiyonu için Basit Bir Davranış Testi<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Subaraknoid kanama, bir fare modeli serebral Vasospasm miktar hacimsel bir yöntemi

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...