Bu protokol, yumurtalık mikro ortamının derinlemesine incelenmesini sağlar. Kullanıcıların folikül büyüme ve gelişiminin yanı sıra steroidogenezi ve bağışıklık moleküllerinin bolluğunu belirlemelerini sağlamak. Bu tekniğin bir avantajı, yumurtalık mikro ortamındaki ve ortaya çıkan foliküllerdeki değişiklikleri doğrudan değerlendirme ve spesifik hormonların eklenmesinden kaynaklanan benzersiz etkileşimi değerlendirme yeteneğidir.
Bu teknik foliküler tutuklamalara neden olan çeşitli üreme bozukluklarını incelemek için kullanılabilir. Örneğin, polikistik over sendromu. Yumurtalık mikro ortamını doğrudan in vitro olarak değerlendirebildiğimiz için, prosedürü gösteren laboratuvarımdan lisans araştırmacısı Brooke Bell olacak.
Cerated çene tokmaklarını kullanarak yumurtalığı sabitleyin, ikiye bölün ve dış dilimleri çıkarmaya başlayın. Medulla toplanmaması için yumurtalıktan en fazla bir ila iki milimetrelik yüzey derinliğinin kesilmesini sağlamak. Yumurtalık korteksinin üç ila dört ince şeridini neşterle kesin ve şeritleri üçüncü PBS dolgulu Petri kabına yerleştirin.
Şeritleri neşter bıçağıyla 0,5 ila bir milimetreküplük küçük kare parçalar halinde kesin. Tutarlı yumurtalık korteks parçaları yapmak için parçaların benzer boyut ve kalınlıklarda olduğundan emin olmak için Petri tabaklarının altında bir cetvel kullanın. Yumurtalık kortikal parçalarını üç PBS ve antibiyotik alanı Petri kabında yıkayın, parçaları yıkamalar arasında hareket ettirmek için kavisli uçlu asalar kullanarak yıkayın.
Korteks parçalarını LB-15 yıkama serisinde hareket ettirin ve son lb-15 dolu Petri kabına yerleştirin. Kapağı hayvan kimliği ve yumurtalık tarafı ile etiketleyin. Yumurtalık başına dört yumurtalık korteks parçası toplayın ve gün sıfır histolojisi için sabitleyin ve RNA saflaştırma için ek parçaları dondurun.
Kalan doku parçalarını kültür için kullanın. Son bir doku yıkama ve kültür hazırlığı için biyolojik bir güvenlik kabini hazırlayın. Malzemeleri biyolojik güvenlik kabinine yerleştirmeden önce% 70 etanol ile sterilize edin.
Kültüre yönelik tüm yumurtalık korteks parçalarını biyolojik güvenlik kabinine taşıyın ve LB-15 dolu petri kabında bir kez daha yıkayın. Pipet 350 mikrolitre Waymouth ortası kuyu başına 24 kuyu doku kültürü plakasına. Kesici ucun tabanının altında kabarcık oluşmamasını sağlamak için forseps kullanarak her kuyuya kaplamasız kültür iyi ekler yerleştirin.
Dört yumurtalık korteks parçasını, ağı delmeden her kesici ucun a örgüsüne dikkatlice ve hassas bir şekilde yerleştirin. Dokuyu %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Yumurtalık korteks kültürünü yedi gün boyunca her gün orta olarak değiştirin ve önceden ısıtılmış Waymouth ortamını kullandığınızdan emin olun.
Orta değişiklikler sırasında, kesici ucu kuyudan hafifçe çıkarmak ve kültürlü Waymouth ortasını 0,5 mililitrelik tüplerde toplamak için tokmak kullanın. Kesici ucu kuyuya geri yerleştirin ve kesici ucun yanı ile kuyu arasına dağıtarak 350 mikrolitre taze kültür ortamı ekleyin. Toplanan ortamı doku kültüründen eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Yedi günlük kültürden sonra, yumurtalık korteksi parçalarını ekli bir kamera ve bir bilgisayar görüntüleme yazılımı programı ile diseksiyon mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Bouin'in histoloji çözeltisinde kuyu başına iki yumurtalık korteks parçasını sabitleyin ve cDNA için RNA elde etmek için sıvı nitrojendeki yumurtalık korteks parçalarına flaş dondurun. Bu adımı dokulu tüm kuyular için tekrarlayın, ardından ortamı yedinci günden itibaren toplayın ve eksi 20 derece depolayın.
Yumurtalık korteks parçalarının Bouin çözeltisine yaklaşık 1,5 saat daldırmasına izin verin, ardından üç kez% 70 etanol ile yıkayın, dokuyu% 70 etanolde tutun ve çözelti artık sarı olmayana kadar günlük olarak temizleyin. Hematoksilin ve eozin lekesi ilkel foliküller, erken primer foliküller, primer folikül, sekonder folikül ve antral folikül için yapıldı. Folikül evrelemesi folikülogenezin değerlendirilmesi için kültürden önce ve kültürü takip eden bir yumurtalık korteksi üzerinde gerçekleştirildi.
Kollajen birikimi ile belirlenen morfoloji farkı, yumurtalık korteksinde merdiven-basamak veya kontrol düvelerinden fibrozis olduğunu gösterebilir. Kontrol ve merdiven basamaklı düveler arasında doldurulur yumurtalık korteksi başına ortalama picrosirius kırmızı pozitif lekeleme alanının karşılaştırılması burada gösterilmiştir. Kültür ortamının günlük koleksiyonu, bir radyoimmunoassay kullanılarak çeşitli steroid hormon üretimini değerlendirmek için üç gün boyunca birikti.
Steroid metabolitleri ve sitokin üretimi de dört günlük kültür boyunca havuzlanmış her hayvan için bir kuyudan yumurtalık korteks kültürü ortamında ölçüldü. Doku ne kadar uzun süre oturursa, çalışmak o kadar zor olabilir. Hassas kesimler yapmanız gerekebilir.
Bu teknik, aşırı steroidlerin sitokin ve kemokin üretimi üzerindeki etkilerini belirlemek ve yumurtalık dokusunda folikül ilerlemesi veya tutuklanması üzerindeki etkilerini belirlemek için aşırı steroidogenezi kurtarmak için sinyal transdüksiyon yolları üzerindeki etkilerini anlamak için kullanılır.
