Bu protokol sperm kapaizasyonu sırasında enerji metabolizmasındaki değişiklikleri izlemek için bir hücre dışı akı analizörü uygulamak için kullanılabilir. Bu protokolü, kondansatif olmayan ve kapasitif fare spermi arasındaki glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak karşılaştırmak için geliştirdik. Tramadan bir gün önce, sensör kartuşunu hücre dışı akı temizleme kitinden çıkarın ve kartuşun ubeyv plakasının yanına ters yerleştirin.
Bir çözelti haznesini 25 mililitre çift distile suyla doldurun ve kullanım plakasının her kuyuya 200 mikrolitre su ekleyin, ardından sensör kartuşunu tekrar servis plakasına yerleştirin. Plakayı 37 derece karbondioksit olmayan bir kuvöze yerleştirin. Sonra, 50 mililitrekonik tüp içine ekstrasellüler akı analizörü calibrant 25 mililitre aliquot ve 37 derece santigrat anti-karbondioksit kuluçka içine tüp yerleştirin.
ConA kaplı mikro plakalar hazırlamak için, çift distile su beş mililitre ConA 2,5 miligram eritmek ve ConA çözeltisi 50 mikrolitre ile bir ekstrasellüler akı analizörü 96-iyi plaka her kuyu doldurmak için çok kanallı pipet kullanın, sonra plaka bir gecede kurumasını sağlamak için kapağı açık bırakın. Sperm tamponunu hazırlamak için 250 mililitre ekstrasellüler akı analizörü TYH tamponunu 37 dereceye ısıtın ve pH'ı 7,4 dereceye ayarlayın. Teşbibin olduğu gün, yardımcı plakanın her kuyudaki suyu kuyu başına 200 mikrolitre XF kalibrant ile değiştirin ve plakayı en az bir saat boyunca karbondioksit olmayan kuvöze geri yerleştirin.
Dalga şablonu oluşturmak için hücre dışı akı çözümleyicisini açın. Sıcaklık 37 santigrat dereceye sabitlenirken, dalga yazılımını açın ve boş bir şablon açın. Grup tanımları sekmesinde, assay ortamını TYH, hücre tipini fare spermi olarak tanımlayarak enjeksiyon stratejilerini ve ön işlemleri boş bırakabilirsiniz.
Her bir teşp koşulu için farklı gruplar oluşturun ve her grubu belirli kuyulara atamak için plaka haritasını açın. Protokol sekmesinin altında, dengeleyin, dört farklı ölçüm döngüsünün her birini ekleyin, ilgili bağlantı noktasını seçin ve enjeksiyondan sonraki ölçünün vurgulanması için ölçüm ayrıntılarını edin, ardından tahkikat şablonuna kaydedin, proje özetini doldurun ve sonuçları kaydedin. Spermhasat önce, 37 santigrat derece TYH tampon 50 mililitre önceden ısıtın.
Yetişkin erkek farelerden cauda hasat ettikten sonra, her kauda'yı önceden ısıtılmış TYH tamponunun 500 mikrolitresine yerleştirin. Her kuyunun alt kısmında ayrı ayrı her kauda hareketsizleştirmek için forceps kullanın ve hızlı bir şekilde tüy makası kullanarak her dokuda beş ila yedi küçük kesiler yapmak. Tüm cauda'lar indiktif edildiğinde, hemen plakayı karbondioksit olmayan inkübatöre yerleştirin ve spermin 15 dakika boyunca dağılmasını bekleyin.
Sensör kartuşunu yüklemek için, sensörün kartuşunun kapağını çıkarın ve ilgili bağlantı noktası yükleme kılavuzunun harfini kartuşun sol üst köşesine hizalayın. Bağlantı noktası yükleme kılavuzunu yerinde tutarak, pipet uçlarını A portunun bağlantı noktası yükleme kılavuzu deliklerine dikey olarak yerleştirin ve her kolona 20 mikrolitre TYH tampon enjekte edin. B limanı için, 22 mikrolitre TYH tamponunu 1'den 4'e kadar sütunlara, 500 milimolar 2-deoksigluküllü 2-deoksigluküllü 22 mikrolitreyi beş ila sekiz arasında sütunlara ve 25 mikrolitre beş mikromolar antimisin A rotenonunu 9'dan 12'ye kadar sütunlara enjekte edin.
C limanı için, her sütuna tek sayılarve 25 mikrolitre dibutyryl-siklik AMP 500 mikromolar IBMX ile 25 mikrolitre TYH tampon enjekte edin, ardından sensör kartuşunu kalibrasyon plakalı bir kalibrasyon plakalı hücre dışı akı analizörüne yerleştirin ve taramaya başlayın. Kalibrasyon 10 ila 15 dakika sürer. Sperm plakalarını hazırlamak için, üç beş mililitrelik santrifüj tüplerinin her birine TYH tamponunda mililitre büyükbaş hayvan serum albumini başına üç mililitre ekleyin.
Sonra, üç 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerin her içine sperm havuz iki kuyu. Saydıktan sonra, büyükbaş hayvan serum albumini ile takviye taze TYH örnek başına mililitre konsantrasyonu başına yedi sperm iki kez 10 için sperm seyreltin. Spermi santrifüj ile tortula çökün ve tyh tamponunun bir mililitresinde sperm peletlerini yeniden askıya alın.
Tekrar sperm santrifüj ve pelet rahatsız etmemeye dikkat supernatants kaldırın. Her sperm süspansiyonu hazırlanan beş mililitrelik santrifüj tüplerinden birine aktarın ve ConA kaplamalı bir plakanın her köşesine 180 mikrolitre TYH tampon ekleyin. ConA kaplamalı plakanın her boş kuyuya 180 mikrolitre sperm ekleyin ve plakayı santrifüjler arasında 180 derece döndürerek iki kez santrifüj edin, sonra kalibrasyon plakasını sperm plakası ile yerleştirin ve taramaya devam edin.
Bu temsili deneyde, sperm sadece enerji substratı ve 2-deoksiglukoz ve antimisin ve farmakolojik modülatörler olarak rotenon olarak glikoz varlığında kapasitiyon edildi. Ok, kapacitation indüksiyongösterir. Glikoz varlığında, kapacitation 2-deoksiglukoz ile glikoli bloke tarafından inhibe ekstrasellüler asitleşme hızında yedi kat artış eşlik etti.
Kapasitif sperm, kapasitif olmayan sperme kıyasla oksijen tüketim hızında 20 kat artış gösterdi ve fare sperminin kapasiasyon sırasında artan enerji talebini desteklemek için hem glikoliz hem de oksidatif fosforilasyonun arttığını gösterdi. Sperm kapaizasyonu sırasında ekstrasellüler asitleşme hızındaki artış oksidatif fosforilasyon inhibitörleri antimisin A ve rotenon bu orandaki değişimin esas olarak glikolizden hidrojen salınımı ile kaynaklandığını gösterir. Oksijen tüketim hızındaki artış, ancak, antimisin A ve rotenon yanı sıra sperm kapaji sırasında OXPHOS artış glikolitik aktiviteye bağlı olduğunu ortaya koyan 2-deoksiglukoz tarafından bloke edilir.
Enerji kaynağı ve farmakolojik aktivatörler ve inhibitörler deneyin amacına bağlı olarak çeşitli olabilir ve 12 farklı koşullara paralel olarak ölçülebilir. Protokol, kapacitation sırasında enerji metabolizmasındaki değişikliklerin eşit derecede esrarengiz olduğu insan veya büyükbaş hayvan gibi diğer türlere kolayca adapte edilebilir.
