The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.

Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> 5.54 g NaCI, 0.356 g KCI, 0.25 g CaCl2, 0.162 g H-2 KO 4 P ve 0.294 gr MgSO 4 Milli-Q su içinde L1 eklenmesiyle Biggers Whitten ve Whitten (BWW) 17 çalışma çözeltisi 200 ml yapmak . Bu stok çözeltisi ve bir aya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Stok solüsyonundan, NaHCO 3 420 mg ekleyin - 200 mg glikoz, 6 mg sodyum piruvat, 600 mg Sığır Serum Albümin, 0.74 ml sodyum laktat ve BWW stokunun 4.0 ml HEPES tamponu 193 mi. Bu çalışma çözeltisi ve her zaman kullanımdan önce gün taze yapılmış ve 37 ° C&#39;de dengelenir. </li><li> Kanül yapmak için, boru erimeye başlar ki (tipik olarak metanol alev) örneğin 0.4 mm bir iç çapa ve 1,1 mm&#39;lik bir dış çapa sahip polietilen (PE) tüp almak ve düşük bir ısı üzerinde tutun. Hemen outw boru çekmeard germek ve dış çapı daha dar yapmak. </li><li> Vaz deferens kolay kanülasyon için izin verir bir ucunda bir daralma üretmek için Kes. </li><li> Yaklaşık 15 cm kanül diğer ucu kesilir. Künt ucunu 30 G iğne takın, ve buna bir 3 ml şırınga takın (tamamen geri çekilmiş). </li><li> PE boru (4.2 mm iç çap, 6.4 mm dış çapında) bir 20 cm uzunluğunda kesilerek bir emme ağızlık yapın. Bir ucunda bir ağızlık yerleştirin. </li><li> Mikro-kapiller cam tüp tutucu ve cam mikro-kılcal kendisi (bir fare için tipik 3 ul, bir sıçan için 40 ul) yerleştirin. </li></ol> Mouse epididimisten 2. Kaldırma <ol><li> Her kuruma özgü IACUC onaylı prosedürlere göre fareler Euthanize. </li><li> Hayvan al ve epididim maruz skrotum küçük bir kesi yapmak. Saatçilik 5. forseps bir çift kullanarak boşluğundan dışarı testis ve epididim çekin. </li><li> Öyle ki en az 1-2 cm kauda epididimise bağlı kalır vas deferens kesin. Buna ek olarak, testis epididim bağlayan proksimal efferent kanalları ve doku kesip tüm erkek üreme parçayı çıkarın. </li><li> 5-40X sırasına göre bir büyütme aralığında olan bir mikroskop altında tüm erkek üreme parçayı yerleştirin. </li></ol> 3. Epididimis cannulating <ol><li> Daralmış (koni şeklinde) sonunda 1-2 cm lens aracılığıyla ücretsiz ve görünür şekilde mikroskop kanül aşağı Teyp. </li><li> Saatçilik 5. forseps bir çift alın ve yavaşça vaz deferens her tarafını toka ve kanül vaz deferens gider şekilde, kanül üzerine vaz deferens çekin. </li><li> Emilmeyen siyah örgülü tedavi ipek (boyut 5-0) uzunluğu alın ve kanüle vaz deferens etrafında bir düğüm. Emin olun düğüm vaz deferens içinde kanül tutmak için sıkı çekildiğinde hava basıncı from şırınga uygulanır. </li></ol> 4. retrograd veya Caudal Epididimal Spermatozoa&#39;lar Ters yıkama <ol><li> Saatçiler 5. forseps kullanarak, kauda epididymisten distal ucunu yakala ve bir tek epididim tübül ortaya koymak için tunika albuginea&#39;yı kaldırın. </li><li> Forseps kullanarak, hafifçe maruz tübül çekin ve sperm serbest bırakılması için bir açıklık oluşturmak amacıyla daha sonra ayrı kızdırmak. </li><li> Vas deferens içine şırınga havayı atmak şekilde yavaşça 3 ml (fare) veya 20 ml (sıçan) şırınga itin. Uygun basınçta, sperm yavaş yavaş kauda epididimis uzak ucunda kırık tübül çıkmaya başlayacaktır. Bu zamanda, cam boru içine sperm çekmek için ağız emme uygulanır. Not: Genellikle bir farede, sperm 2-3 ul hayvanın yaşına bağlı olarak elde edilebilir. Bir sıçan irade, ortalama verim 30-40 ul üzerinde. </li></ol> 5. Yıkamave Proteomics Hazırlık spermatozoa Parçalama <ol><li> Yavaşça mikrofona üfleme veya bir şırınga takmak ve kılcal geri sperm itmek üzere havayı atarak BWW çözeltisi 1 ml çözelti (37 ° C) içine cam kapiller gelen sperm kovmak. </li><li> Sperm hücrelerinin dağınık sonra, kirletici proteinleri uzaklaştırmak için 1 mi oranında BWW ile 3 kez (300 x g, 5 dakika) yıkanır. Son yıkamadan sonra, süpernatant kaldırmak. Not: Bu noktada, sperm hücreleri daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. </li><li> Aralıklı vorteks ile 1 saat süre ile 4% CHAPS, 2M tioüre ve 50 mM Tris, pH 7.4 kullanılarak proteinleri çözünebilir hale getirdi. </li><li> Hücreler, santrifüj (10,000 x g, 20 dk) Lize etme sonrasında üstteki sıvı kısmı alınır ve yeni bir tüpe aktarılır. Not: Bu noktada, protein, miktar tayini yapılabilir. </li></ol> 6. disülfit bağ Azaltma ve Alkilasyonu <ol><li> Lize proteinlere nihai bir konsantrasyona kadar 10 mM DTT ekleme Vorty ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Lizat, girdaba nihai bir konsantrasyona kadar 50 mM idodoacetamide ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li></ol> 7. Yağış <ol><li> Metanol kloroform, lizatın 1 hacim (örnek olarak 400 ul) ekleyerek örnek çöktürmek metanol bir hacmi (400 ul) ve 0.5 hacim (200 ul) kloroform ekleyin. </li><li> Vortex örnek ve spin (10.000 xg, 2 dk). </li><li> Iki faz santrifüj aşağıdaki görüneceğini unutmayın. Üst tabaka (dikkatli olmak arayüzü rahatsız değil) bütün fakat 2 mm atın. </li><li> Metanol 1 hacim (400 ul) ekleyin, invert tüpü yavaşça (10.000 xg, 15 dk) karıştırın ve tekrar dönmeye 1-2x. 3-4 dakika atık süpernatant ve hava kuru pelet atın. </li></ol> 8. Tripsin Sindirim <ol><li> 50 oranında 1 M üre ihtiva eden 25 mM amonyum bikarbonat içinde tripsin sulandırın: 1 (a / a protein: tripsin) ve ove kuluçkalanmıştırtercihen bir termomikser üzerinde 700 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de rnight. </li><li> Sıkma (10,000 x g, 15 dakika) sindirilmemiş malzeme peletlendi. Yeni bir tüpe süpernatant aktarın. </li></ol> 9. phosphopeptide Zenginleştirme <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 18 sindirmek triptik gelen arınma ve Phosphopeptides zenginleştirme gerçekleştirin. 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic asit (DHB),% 80 (h / h) ACN (asetonitril),% 2 (v / v) TFA (trifluoroasetik: Triptik peptitler DHB tamponunda 10 kat seyreltilir [DHB tamponu oluşmaktadır asit)] ve Tio 2 boncuk (200 mikrogram) kurumaya geçerlidir. </li><li> 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, bir döndürücü üzerinde bırakın. </li><li> DHB tamponu ile örnek yıkayın dönmeye ve süpernatant kaldırmak. Daha sonra numune, yıkama tamponu [% 80 ACN (h / h),% 2 TFA (h / h)], DHB &#39;nin çıkarmak için üç kez yıkayın. </li><li> Nihai döndürmesi sonrasında doğrudan% 2.5 amonyum hidroksit 25 ul, pH ≥ 10.5 çözeltisinin eklenmesiyle elüsyon tamponu kullanılarak fosfopeptidler tasfiye edilir. Spin ve süpernatant kaldırmak. Hemen ~ 0.3 ul formik asit ile nötralize. </li></ol>

<ol>
	<li>Blandau, R., Rumery, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+swimming+movements+of+epididymal+spermatozoa+to+their+fertilizing+capacity.">The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity.</a> Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).</li><li>Tournade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diff&#233;rence+de+motilit&#233;+des+spermatozo&#239;des+pr&#233;lev&#233;s+dans+les+divers+segments+de+l&#8217;&#233;pididyme.">Diff&#233;rence de motilit&#233; des spermatozo&#239;des pr&#233;lev&#233;s dans les divers segments de l&#8217;&#233;pididyme.</a> C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).</li><li>Wyker, R., Howards, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+studies+of+the+motility+of+rete+testis+and+epididymal+spermatozoa.">Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).</li><li>Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+germ+cell+gene+expression.">Male germ cell gene expression.</a> Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).</li><li>Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).</li><li>Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+structure+and+remodelling+during+sperm+maturation+in+the+epididymis.">Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis.</a> J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).</li><li>Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Epididymis. 3, 1072-1120 (2006).</li><li>Lacham, O., Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+epididymal+and+testicular+spermatozoa+microinjected+under+the+zona+pellucida+of+the+mouse+oocyte.">Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte.</a> Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).</li><li>Bedford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+duct+ligation+on+the+fertilizing+ability+of+spermatozoa+from+different+regions+of+the+rabbit+epididymis.">Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis.</a> J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).</li><li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+function+of+the+epididymis.">Studies on the function of the epididymis.</a> Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).</li><li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+spermatozoa+in+the+rabbit+epididymis:+effect+of+castration+and+testosterone+replacement.">Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement.</a> J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).</li><li>Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+sperm+maturation+in+vitro+in+epididymal+cell+cultures+of+the+tammar+wallaby+(Macropus+eugenii):+disruption+of+motility+initiation+and+sperm+morphogenesis+by+inhibition+of+actin+polymerization.">Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization.</a> Reproduction. 124, 107-117 (2002).</li><li>Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SRC+as+a+key+PKA-stimulated+tyrosine+kinase+involved+in+the+capacitation-associated+hyperactivation+of+murine+spermatozoa.">Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa.</a> J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).</li><li>Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+consequent+stimulation+of+the+tyrosine+kinase+c-Abl+by+PKA+in+mouse+spermatozoa;+its+implications+during+capacitation.">Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation.</a> Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).</li><li>Baker, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Titanium+Dioxide+To+Find+Phosphopeptide+and+Total+Protein+Changes+During+Epididymal+Sperm+Maturation.">Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation.</a> J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).</li><li>Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Ejaculatory+Changes+in+the+Metabolic+Status+of+Rat+Spermatozoa+as+Measured+by+GC-MS.">Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS.</a> Metabolomics. 11, 1-14 (2012).</li><li>Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The culture of mouse embryos in vitro. , (1971).</li><li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).</li><li>Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+using+titanium+dioxide.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide.</a> Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).</li><li>Thingholm, T. E., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+titanium+dioxide+micro-columns+to+selectively+isolate+phosphopeptides+from+proteolytic+digests.">The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests.</a> Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).</li><li>Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+signal+transduction+pathways+during+epididymal+maturation+is+calcium+dependent.">The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent.</a> Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).</li><li>Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+HSP-90+During+Mammalian+Sperm+Capacitation.">Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation.</a> Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).</li><li>Jones, R., Mann, T., Sherins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidative+breakdown+of+phospholipids+in+human+spermatozoa,+spermicidal+properties+of+fatty+acid+peroxides,+and+protective+action+of+seminal+plasma.">Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma.</a> Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).</li><li>Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+activation+and+second+messenger+signalling+in+spermatozoa+from+rat+cauda+epididymidis.">Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis.</a> Reproduction. 125, 175-183 (2003).</li><li>Nolan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-specific+protein+kinase+A+catalytic+subunit+C{alpha}2+orchestrates+cAMP+signaling+for+male+fertility.">Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).</li><li>Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+role+of+SRC+in+capacitation-associated+tyrosine+phosphorylation+of+human+spermatozoa.">Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).</li><li>Leclerc, P., Goupil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+human+sperm+tyrosine+kinase+c-yes.+Activation+by+cyclic+adenosine+3',5'-monophosphate+and+inhibition+by+Ca(2).">Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2).</a> Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).</li><li>Krapf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Ser/Thr+phosphatases+induces+capacitation-associated+signaling+in+the+presence+of+Src+kinase+inhibitors.">Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors.</a> J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).</li><li>Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+spectral+counting+in+quantitative+proteomics.">Role of spectral counting in quantitative proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).</li><li>Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+isotopic+labeling+and+mass+spectrometry+to+analyze+capacitation-associated+changes+in+the+phosphorylation+status+of+mouse+sperm+proteins.">Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins.</a> J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

sperm başarılı ve tekrarlanabilir proteomik analiz için kritik adımlar şunlardır: başlangıç ​​malzemesinin 1) saflık; İstenmeyen tuzların ve deterjanların 2) çıkarılması; Tripsin proteinleri, yüksek bir verim sindirimi izin verecek şekilde 3) tam kapasitede proteinleri denatüre ve 4) peptidin kaybını azaltmak için kullanım örneği en aza indirir. Başarılı bir şekilde cauda epididimisi Geri akış için, bu sperm çıkar olan alan bulmak için gereklidir. Sıçan ve farelerin her ikisinde de, bu epididimis kaudal bölgenin ortasında (Şekil 2A &#39;ya bakınız), konkav alanın üst ucunda. Bir vas deferens doğru daha gelirse, geri yıkama kolay ve başarı oranı genellikle yüksektir. Ancak, bu sperm sayılarının kaybı geliyor. Bir külliyatı daha yakın hareket ettirmeye çalışır Alternatif olarak, eğer o basınç miktarı epididymis yoluyla geri sperm itmek için gerekliEl kanallar epididime hasar kaçınılmaz oluşur, genellikle çok yüksek. Epididimis Ters yıkama geleneksel sperm 22-25 kaldırmak için su, doymuş, mineral yağ ve bir ortam olarak şırınga kendi içinde dengeli tuz çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilir. Her iki prosedürler LC-MS potansiyel sorunludur. İlk olarak, maden hiçbiri prosedürü taşınan böylece alınmalıdır temel proteomik analizi ve bakımı için dünya çapında kullanılan nano-C18 nano sütun engellemek için olasıdır. Bu durum ortaya çıkarsa, devam etmek imkansız ve örnek aslında kaybolur. Bu, başarılı olsa da, yakında BWW çözelti temas gelen en kısa sürede sperm çok hareketli hale kabul kaudal epididimal ile karıştırılır, ancak oranında BWW veya şırınga diğer dengeli tuz çözeltileri kullanılarak aşılabilir Hücreler. Bu sorunu aşmak için biz sadece hava ile sperm Backflush. Sadece Qual olansıvı bazlı yöntemler karşılaştırılabilir sperm Sığ, ama miktarı aynıdır. Phosphoproteomics belki sinyal yolları sperm sonrası boşalma meydana hangi kurmak için tek yollarından biridir. Biz araştırıyoruz önemli yollardan biri kapasitasyon işlemidir. Bir yumurta bağlanabilen önce spermatozoa &quot;kapasitasyonu&quot; geçmesi gerekmektedir. Uygulamada, bu, bir süre için sperm inkübe edilerek esas olarak elde edilir (sıçan 1.5 saat, fare, 40 dakika, insan 3-24 saat), serum albümini BWW çözelti içinde gerçekleştirilir. Daha önce, ve diğerleri kapasitasyonu ilgili çeşitli kinazlar için bir rolü olduğunu göstermiştir. Ilgi, PKA silinmesi II olan sperm in vitro kendiliğinden yüzmek fareler üretmek, ancak hiperaktivasyondan 26 uğramaz edebilir μ. İkinci sperm bir düşüğe, yüksek hız, düşük genlikli kendi yüzme desen değiştirmek sayede, kapasitasyon bir özelliğidirhız, yüksek genlik frekans yendi. Biz bu süreçte yer alan mansap kinazlar pp60-CSRC (SRC) dahil göstermiştir 13,27 c-evet 28 ve c-ABL 14. İlginç bir şekilde, SRC inhibisyonu kapasitasyon bağımlı tirozin fosforilasyonunu 13 durur. Bununla birlikte, bu, SRC doğrudan tirosin fosforilasyonu 29 genel başlaması ile ilintili olan değil ama bir fosfatazı 29 regüle olabileceğini düşündürmektedir okadaic asit ile aşılabilir. epididim dışarı sperm zorlamak için bir araç olarak BWW kullanarak sorun bir kez aktive, fare sperm sadece yetkilendirmek için yaklaşık 40 dakika sürer olduğunu. Sperm izolasyonu 5 dak / fare ve genellikle birkaç fareler deneyde kullanılan alabilir göz önüne alındığında, daha sonra sperm deneyin başlangıcında vade farklı aşamalarında olur. Bunun üstesinden gelmek için, hava basıncı, cam kanül içine kuyruk epididimden sperm itmek için kullanılabilir. Sadece tüm sperm İnakt vardırive ve kaudal ortamda bulunacağını esas olarak, bu mümkün olmayan hareketli ve hareketli phosphoproteomics karşılaştırmak için yapar. Iki farklı fonksiyonel durumlarda sperm karşılaştırırken phosphoproteomics için işleme örnek minimumda tutulmalıdır. Protein yağış 1) diğer geleneksel yöntemlere göre metanol kloroform kullanımı 2) tuz ve yağ hemen hemen tüm izlerini ortadan kaldırır ve 3) TCA 19 üzerinde düşük bolluk proteinleri çöktürmek için kanıtlanmış bir yeteneği vardır, ekstra yıkama adımlar ihtiyacını azaltır. Tripsin sindirimi öncesinde protein yağış proteini (tripsin sindirim yardımcı olan) denatüre bu yardım yapar, ancak hücre içinde bulunan MS-uyumsuz metabolitlerin birçok kaldırır sadece beri tavsiye edilir. Sperm Phosphopeptides karşılaştırması çeşitli şekillerde yapılabilir. Başka bir bu temel düzeyde bir numunede belirlenen fosfopeptid basit bir karşılaştırılması, en&quot;spektral sayımı&quot; olarak bilinen işlemde örnek yapılabilir. Erken proteomik çalışmalar düşük çoğaltır kullanılarak çünkü Ancak eleştiri temelde bu yaklaşım olmuştur (dolgun bir tartışma için Lundren ark. 30). Daha sofistike bir yaklaşım peptit ana kütlesinin yoğunluğu bakmak ve diğer örneklerin (etiket ücretsiz karşılaştırma) ile bu karşılaştırmaktır. Şekil 4&#39;te gösterilen örnekte, m / z 650-670 olmayan hareketli dan (Şekil 4) durumunda mevcut değildir fakat hareketli olarak mevcut olan bir peptit (Şekil 4 alt) sperm görülebilir. MS temelli etiket serbest miktar olarak adlandırılır Bu işlem, bir etiket içermeyen bir stratejidir. Yaygın proteomik ölçümü için gerekli çalışan miktarını azaltmak için kullanılan alternatif bir strateji izotopları kullanmaktır. Bir izotop kütle farklı olduğu için, kütle spektrometresi elüt yoğunluklarını karşılaştırmak için kullanılabilirpeptidler ing. Bununla birlikte, diğer hücre tipleri farklı olarak, bazı izotopik etiketleme sperm tatbik edilemez. Doku kültüründe kullanılabilir Örneğin, kararlı izotoplar eklenmesi (bir hafif bir versiyonu başka ilave alır iken bir ağır izotop, bir örneğe eklendi alır). Izotoplar protein içine dahil olsun zaman, proteomik analizi iki numune (çoklayıcı) birleştirilmesi ile gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte sperm durumunda bu, 1) izotop işaretleme doku kültüründe () 8 kadar çeşitli pasajlar gerektirir ve 2), sperm hücreleri, bu nedenle herhangi bir nükleer gen, transkripsiyon ve çeviri sahiptir ve bu sadece gerçeği sayesinde, yapılamaz onlar zaten tüm protein içine izotopları dahil değildir. Bu etrafında bir yolu, radyo-etiketli fare sipariş etmek, bununla birlikte, bu bildiği pahalıdır. Alternatif bir yaklaşım kimyasal etiketi kullanmaktır. Bu sigara kapasitan fareler kapasitan fareler ile karşılaştırıldığında yapılmıştır. Bu durumda, D 0 ve D ise <sub&gt; 3 -label kütle spektrometresi 31 bir örnek ve bir başka ayırt etmek için kullanıldı. Diğer yaklaşımlar lizinlerinin farklı kütle izotoplar ile kimyasal olarak etiketlenmiştir böylece iTRAQ (nispi ve mutlak miktar tayini için izobarik etiketi) kullanımını içerebilir; sisteinler farklı kütle izotopları ve ağır ve hafif su etiketleme ile etiketlenmiş sayede iCAT (izotop kodlu afinite etiketi). Her durumda, bununla birlikte, tek bir şey akılda tutulması gerekmektedir. MS, sadece bir numunede mevcut olanı raporları, ve bu o noktaya o örnek up oldu her şeyin bir yansımasıdır. Her adımda veriminin maksimize ederken örnek işlemlerine en aza indirmek başarılı proteomik analizi için gereklidir.

Testisten çıkan sonra, sperm oldukça henüz belirgin ayırt edilir, bu hücreler olgunlaşmamış 1,2 bulunmaktadır. Gibi, onlar oosit 3 yüzmeye yeteneği ve bağlama dahil, komple işlevselliği eksikliği. Sperm daha olgunlaşması gerekmektedir, ancak, hücre farklılaşma bu aşamasında, bu gen transkripsiyonu ve daha fazla protein biyosentezi 4 yetersiz olduğundan, bu kanonik yollar ile meydana gelemez. Onlar testis terk ve epididim 5 olarak da bilinen erkek üreme sisteminin bir parçası girerken Biyolojik yetkinlik sperm üzerine haiz. epididimis vaz deferens için (testis) efferent kanalları birbirine bağlayan ve tüm erkek memelilerde 6 mevcut olan sıkı sarmal, son derece farklılaşmış tüp. Spermatozoa kademeli cr olduğunu sürekli değişen lümen ortama dayanarak, epididim iniş sırasında gübreleme potansiyeli kazanmakYerel epididimal epitel hücreleri 7 ile Eated. epididim ortam eyleminde bulunan çeşitli salgı ve yeniden emici faaliyetler protein, karbonhidrat ve lipid kompozisyonu 6 değişen, sperm kendisi değiştirmek için. Bu yapının özellikle ilk &#39;caput&#39; bölge epididimis önemi, cerrahi ligasyon teknikleri kullanılarak 8 örneklenmiştir. Efferent kanalı ligasyonu ile testis içinde sperm tutulan tamamen oosit 9-11 döller herhangi bir sıfatla eksiktir. Epididimal ortamına ek olarak, sperm çalışma içinde sinyal iletim yolları translasyon sonrası mevcut sperm hücresi tamamlayıcı değiştirmek için kullanılır. Örneğin, epididim erken bölgelerinden sperm bu ikinci bölgelere 5,12 oranla protein fosforilasyon farklı desen görüntüler. C büyük farklılıklar vardır çünkü bu şaşırtıcı değilBu bölgelerden sperm apability. Örneğin, erken gelen, epididim kaput spermatozoa immotilite vardır. Buna karşılık, kauda bölgeden sperm hücreleri ileri bir kez izotonik ortamda yerleştirilen ilerici hareketliliğini uğrayacaktır. Epididimal sperm hücrelerinin de novo protein sentezi aciz olduğu için, sperm fonksiyonunu düzenleyen tüm iç yolları post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) üzerinden olmalıdır. Bu nedenle, bu işlenmektedir nedenle duruyor ve biz sperm hücresi olgunlaşmasını anlamak istiyorsak özellikle fosforilasyon gibi PTMS soruşturma büyük bir itme olmalıdır. Alternatif bir yöntem, 13-16 retro geri akışlandırma kullanımı epididymidies spermatozoa elde edildi. Bu tekniğin kesinlikle daha zaman alıcı ve operatör tarafından beceri büyük bir derecesi alır rağmen, sperm sürekli% 99,99 aşan saflığını göstermek aldı. Buna ek olarak, tüm diğer tekniklerin aksine, sperm can mümkün sperm hareketliliği nasıl başladığı çalışma yapma, hareketsiz bir durumda izole edilebilir. Numune hazırlama proteomik analiz için en önemli unsur olduğundan, sperm izolasyon sperm proteomik çalışmaların en önemli yönlerinden biri haline gelmiştir. Bu protokol kauda epididimis izole nasıl sperm bir açıklama sağlar. Bunu takiben, TiO2 fosfopeptid zenginleştirme işlemi son derece farklılaşmış sperm hücrelerinden peptidler ayıklamak için nasıl özel referans ile, ana hatlarıyla. MS yaklaşım bir tek devlet kaudal epididim sperm karşılaştırmak olsaydı değişen Phosphopeptides ayırt etmek için kullanılabilir (hareketsiz veya non-kapasitan) sperm incelemek için bu güçlü bir yaklaşım yapma (vb, tepki gösterdi hareketli, kapasitan akrozomun) başka işlevi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>195464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-D Quantitation Kit</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>80-6483-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonia Solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>1300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10077.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O6440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine-L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes (free acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetic acid free acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Res. Org.</td>
			<td>0090M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10158.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll (sterile)</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>GEHE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td>
			<td>PIE78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Medical Store</td>
			<td>CH 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10247.4V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure Grade</td>
			<td>Amresco (Astral)</td>
			<td>AM0497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin Gold-Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">NN2038R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">SS035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4.2 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Braided silk (5-0)</td>
			<td style="width:175px;">Dynek</td>
			<td style="width:129px;">CSS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TiO2 beads (from disassembled column)</td>
			<td style="width:175px;">Titansphere</td>
			<td style="width:129px;">6HT68003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C7B30</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">C0856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphopeptide analysis of rodent epididymal spermatozoa

Spermatozoa hücre tipleri arasında oldukça özeldir. Testiste üretilen rağmen ön-imleç yuvarlak hücreli uzatılmış ve morfolojik bir spermin olarak tanınan ne içine ayırt başlar kez, hem nükleer gen transkripsiyonu ve çevirisi kapatılır. Ancak, sperm hareketliliği veya yumurta tanınması için hiçbir yeteneğine sahip, çok olgunlaşmamış olduğunu. Bu olayların her ikisi de sperm geçiş kez epididim olarak bilinen ikincil bir organ meydana gelir. Bir sperm hücresi epididime geçmesi için gereken ~ 12 gün geçişi sırasında, mevcut proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlar hücre olgunlaşmasında önemli bir rol oynamaktadır. Böyle bir büyük faset protein fosforilasyonu olduğunu. Sperm olgunlaşması sırasında oluşan fosforilasyon olaylarını karakterize etmek amacıyla, saf sperm hücresi popülasyonları ve Phosphopeptides ön ayırma hem de tespit edilmelidir. Saf sperm o izolasyonu için, bir yöntem yıkama teknikleri geri kullanmadistal veya kuyruk epididymisten f kaliteli ve verim özetlenmiştir. çözülmesi, sindirim ve TiO2 afinite kromatografisi aracılığıyla spermin Phosphopeptides ön paya ayırma için adımlar açıklanmıştır. İzole sonra, fosfopeptidler, sperm olgunlaşması işlemleri sırasında fosforilasyonu yer alarak seviyelerini spesifik amino asit kalıntıları iki protein fosforilasyon olaylarını belirlemek ve ölçmek için, MS içine enjekte edilebilir.

Herhangi bir proteomik analiz sonuçlarının kalitesi başlangıç ​​malzemesinin büyük ölçüde bağlıdır. Modern MS ile, örnek hazırlıkları hafif kirlenmeler kolayca toplanır. Bu nedenle, son derece saf sperm veren bir yöntemi seçmek için, sperm hücresi proteomik durumunda, önemlidir. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, retrograd geri yıkama kauda epididimis sperm hücrelerini almak için kullanılır. Bu, bir yavaş yavaş ekli şırınga hava basıncını uygulamak sağlar PE boru ile vas deferens cannulating içerir. Şekil 1A vas deferens ile birlikte kauda epididimiti göstermektedir. Şekil 1B vaz deferens bağlı nasıl bir kadar yakın çekim olduğu kanül yerleştirilir. Yaparken, bu yüzden sperm kuyruk epididymisten bir tübül eksize sonunda serbest bırakılır. Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, sperm Caud tepe bölgelerinden ekstre edilmiştirBir Epididimis ve hareketsiz bir durumda (Şekil 2B) bir cam boru içine kadar emilir. Bu daha önce ve hareketlilik aktivasyonu sonrası sperm bir phoshoproteomic analizini gerçekleştirmek için yeteneği en az olan geleneksel &quot;swim-up&quot; yöntemleri, üzerinde birçok avantajı vardır. sperm sonra kişinin seçim ortamına ihraç edilebilir. Şekil 2C (sol taraf) sperm BWW ortama sınırdışı hemen sonra nasıl görüneceğini gösterir. Hücrelerin çoğu kümeleştiler edilir. Onlar solüsyonu (Şekil 2C, sağ tarafı hücreleri) içine homojenlik dışarı yüzmek Ancak, hücrelerin 10 dakika sonra yetkinlik gösterilmiştir. Geri yıkama tekniği sperm hücreleri çok az etkisi olduğundan, biz yakın% 100 motilite almak ve hücreler dış provokasyon olmadan ortama hızla dağılırlar. Tipik bir geri yıkama deneyde, sperm İsviçre-fare içerir kurtarıldı6 10 x 1-5 arası hücre. Bu hayvanın yaşına bağlıdır ve farklı fare suşları arasında değişebilir. Norveçli Rat, biz genellikle 200 x 10 6 sperm elde,% 20 ±. Şekil 2B sıçan kauda epididimis elde edilen sperm saflığını temsil eder. Numune kendisi dışında, örnek hazırlama ile ilgili önemli konulardan biri tripsin sindirimi ürünüdür. Protein çökeltme de proteinleri denatüre sadece MS ile uyumlu olan, her ikisi de, istenmeyen deterjanlar ve bunların tuzlarını, ortadan kaldırılması, çok önemli bir rol oynar. En iyi çalışması için metanol-kloroform çökelmesini bulduk. Sadece bu prosedür TCA yağış 19 olmak üzere diğerlerinden daha iyi düşük bol protein çöktürmek bildirilmiştir, ancak ek avantajlar sahiptir. TCA ile presipitasyondan sonra, oldukça kalabilir TSA pelletinin süspansiyonu ardından pH yeniden ayarlamak için genellikle gereklidirasidik. TCA Çökelen topak asiti çıkarmak için yüksek organik çözeltiler içinde yıkanabilir olsa da, bu taşıma ve sonuçların irreproducibility örnek ekler. Asidi nötralize etmek için ihmal kötü triptik peptid verimi ile sonuçlanır. Metanol-kloroform yağış sadece hızlı ama örnek asitleştirmek olmaz. 3 tipik alt ve üst interfazda arasındaki numune 100 ug görülen protein pelet göstermektedir Şekil. Phosphopeptides izolasyon bir dizi yolla meydana gelebilir; Ancak uyarlık örneği bu aşamada dahil kadar ele alınmış ve nasıl bağlıdır. Daha yaygın, gelişmekte olan yöntemlerden biri de TiO2 olduğunu, aslında Martin Larsen 18,20,21 grubu tarafından geliştirilen. Microcolumns kullanmak için bir işlem olarak açıklanmaktadır, ancak biz toplu kromatografisi kullanılarak tekrarlanabilir verileri de elde edebilir. sürecin başarısı elüsyon tamponu üzerinde bağımlı olduğu, deli olan olmalı<html> Doğru bileşim ile, e; aksi takdirde fosfopeptidler hiç ayrıştırılmıştır değildir. TiO2 gelen protokol ve temsil verilerin tekrarlanabilirliği olmayan hareketsiz (Şekil 4 üst) ve m hareketli (Şekil 4 alt) devlet içinde kauda epididim sperm Phosphopeptides zenginleştirilmiş / z 650-670 görülebilir. Bu biyolojik çoğaltır 17 kullanıldığında bile bir çok tekrarlanabilir bir teknik olduğunu göstermiştir. zaman içinde ortaya çıkan mavi çizgiler asetonitril konsantrasyonu arttıkça, bir C 18 nano sütunundan elüsyon peptidlerdir. Açıktır ki, hareketli popülasyonda (n = 3, gösterilen, n = 8, tipik olarak çalışır), hareketsiz aralığında tamamen yok 651,5 Da aralığında etrafında monoizotopik kütle ile, bir peptid kümesi vardır. Tandem kütle spektrometresi bu peptidi tanımlamak için kullanılır. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. Kauda epididimis kauda epididimis Kanülasyon (A) Resim. kanül kendisi önceden çekti sonundan itibaren yaklaşık 1-2 cm maruz aşağı bantlanmış. Bu ince # 5watchmakers forseps kullanarak vas deferens sokulur. (B) kanül vaz deferens ve kanül ikisini de içeren bir segmente çevresindeki ince ipek ipe yerinde tutulur. Fare kaynaktan, kuyruklu epididimal hücreleri ve sıvının yaklaşık olarak 2-3 ul, 1 x 10 6 / ul konsantrasyonunda toplanır. Sıçan (gösterilmemiştir) ilgili sıvının yaklaşık olarak 30-40 | il benzer konsantrasyonlarda elde edilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Şekil 2: Yetkili epididim sperm toplamak için kullanılan cam kılcal. (A) kauda e apeksten biri tübül<html> pididymis izole ve kırık. Bu gösterilen husule geldiği yaklaşık konum. (B) Görüntünün üst bir boş cam kapiller tüp gösterir ve alt önceden akıtmaya sıçan birini göstermektedir. Kan kontaminasyon ve minimal epitel hücre kontaminasyonu vardır. (C) sperm hala epididim sıvısında inceltilmiş gibi, onlar etkinleştirmek için başlamamıştır. Sperm başlangıçta BWW çözeltisi içine atılır, onlar bir kompakt &quot;string&quot; (Sol taraf) olarak çıkıyor. 10 dakika sonra sperm çoğu herhangi bir harici rahatsızlık (Sağ taraftaki) olmadan çözelti içine yüzmek beri hücrenin yetkinlik kolayca kurulur. (D) onlar yüzmeye bırakılmış hemen sonra kaudal epididim hücrelerinin bir kısım bir resmi dışarı hücrelerin saflığını gösterir. g3highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 3:. Metanol-kloroform çökeltme sonra sperm çözünür olması, çözünür pay metanol-kloroform proteinleri ve kirletici maddelerin çıkarılması denatürasyonunu sağlamak için çökeltilir. protein topağı metanol / su ve kloroform fazlan arasındaki arabirimde görüntülenir. Bu pelet rahatsız etmemek için üst tabaka dikkatlice çıkarılır. Bu, protein kaybolur, böylece, üst fazın yaklaşık 2-3 mm bırakmak için yaygındır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Şekil 4:. Tipik TiO2 bakımından zenginleştirilmiş fosfopeptid profili açıklanan protokolü kullanarak, kaudal epididimal sperm (üst N = 3) hareketsiz ya izole edildi ya da hareketli devletler (alt, N = 3). ~ 651,5 D bir mono-izotopik kütle ile bir peptid kümesiBir hareketsiz olanlar (ok) hareketli populasyonda bulunan fakat tamamen yok olduğu gösterilmektedir. Bu tür karşılaştırmalar &quot;etiketi içermeyen (MS bazlı)&quot; olarak adlandırılır. Peptit, kitle ve tutma süresi, sonra peptid türetildiği proteinin tandem-kütle spektrometresi için bileşiği hedeflemek ve tanımlamak için kullanılır.

Watch this Scientific Journal Video about Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa at JoVE.com

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Kemirgen Epididimal Spermatozoa&#39;lar phosphopeptide Analizi

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

phosphopeptide-analysis-of-rodent-epididymal-spermatozoa

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Görüntüleme.  University of Newcastle. Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Video: Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Biyoloji

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

Yeni Cerrah Kemirgen Cerrahisi İlkeleri

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenik Kemirgen Deneyi sayısallaştırabilmek Erkek Germ Hücre Mutant Frekans

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Miyokard Performans ve Oksijen Tüketimi İnceleme Kemirgen Çalışma Kalp Modeli

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Su Macroinvertebrates kullanma gruba özel rDNA astar genetik Gut içerik analizleri için laboratuvar iletişim kuralı

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents have become essential models for cardiovascular research. However, spontaneous lethal cardiac arrhythmias that often cause mortality in heart disease patients are rare in rodent models of heart disease. This is primarily due to the species differences in cardiac electrical properties between human&#160;and rodents and poses a challenge to the study of cardiac arrhythmias using rodents. This protocol describes an approach to enable efficient transgene expression in mouse and rat ventricular myocardium using echocardiography-guided intramuscular injections of recombinant virus (adenovirus and adeno-associated virus). This work also outlines a method to enable reliable assessment of cardiac susceptibility to arrhythmias using isolated, Langendorff-perfused mouse and rat hearts with both adrenergic and programmed electrical stimulations. These techniques are critical for studying heart rhythm disorders associated with adverse cardiac remodeling after injuries, such as myocardial infarction.

The present protocol describes methods for transgene expression in rat and mouse hearts by direct intramyocardial injection of the virus under echocardiography guidance. Methods for the assessment of the susceptibility of hearts to ventricular arrhythmias by the programmed electrical stimulation of isolated, Langendorff-perfused hearts are also explained here.

Kemirgen Kalplerde Viral Transgen Ekspresyonu ve Kardiyak Aritmi Riskinin Değerlendirilmesi

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...