Nörosfer tsay, nöral kök/progenitor hücrelerinin hem fizyolojik hem de patolojik bağlamda çoğalma, kendini yenileme ve çok köse gibi doğal özelliklerini incelemek için in vitro tekniğinde yararlıdır. Üç boyutlu yapısı nedeniyle, bu teknik yetişkin nörogenezi incelemek için güçlü bir araçtır. Ayrıca culturing ve nöral kök / progenitor hücrelerinin daha yüksek verim elde etmek için yararlıdır.
Bu nörosfer tsay Alzheimer ve Parkinson hastalıkları veya multipl skleroz gibi beyin bozukluklarının çalışma uygulanabilir. Nörosferler de diğer beyin bölgeleri veya sistemleri elde edilebilir, yağ dokusu veya bağırsak gibi. Filipa Ribeiro ile prosedür gösteren Rita Soares, benim grupta bir doktora öğrencisi olacak.
Doğum sonrası gün bir ila üç fare beyinleri hasat için, baş Tabanında vücudun ventral kısmını tutun ve kafatası ortaya çıkarmak için başın tüm uzunluğu üzerinde deride bir orta hat kesi yapmak için küçük sivri makas kullanın. Kafatasının tabanında uzunlamasına bir kesi yapın ve beyin yapılarına zarar vermemek için sagital sütür boyunca mümkün olduğunca sığ bir açıyla kesmeye devam edin. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını yanlara soymak ve beynin tabanına bağlı kranial sinirleri ve kan damarlarını kesmek için beynin altında küçük bir spatula kaydırmak için kavisli forceps kullanın.
Antibiyotiklerle birlikte soğuk HBSS bir Petri kabıiçine beyin yerleştirin ve düşük büyütme bir diseksiyon mikroskop altında çanak yerleştirin. Beyni sırt yüzeyine yerleştirin. Beyincik tarafından beyin tutarken, beynin ventral tarafında menenjler ve koku ampuller kaldırmak için ince forceps kullanın.
Ventral yönü üzerine beyin döndürün ve menenjler geri kalanı soyma. Sonra beyincik kaldırmak ve bir doku helikopter üstünde 11 mikrometre gözenek ile filtre kağıt üzerine beyin aktarmak için kavisli sivri forceps kullanmak için forceps kullanın. SVZ ve DG mikrodiszeksiyon için, 450 mikrometre koronal kesitler içine beyin doğrama ile başlar.
Bir diseksiyon mikroskop altında soğuk antibiyotik takviyeli HBSS ile dolu yeni bir Petri çanak içine kesitli beyin toplamak için ıslak bir lamina kullanın ve lateral ventriküller ile dilimler ulaşılana kadar bir anterior-posterior moda koronal dilimleri ayırmak için forseps kullanın. Striatal parankim ve korpus callosum hariç, ventriatal parankim ve korpus callosum hariç ve svz izole etmek için lateral ventrikül hemen bitişik doku içine forseps bir ucunu yerleştirin ve ventriküllerin lateral ventrikül in ince tabakası nı kesmek için ince forseps kullanın. Lateral ventrikül çevreleyen dokuların küçük bir çizgi kesin ve takviye HBSS çözüm içeren bir örnek tüp içine parçalanmış doku toplamak.
Tüm dilimler forceps ve hipokampal formasyon ulaşmış ile mikrodissected edilmiş zaman, Hangi DG hala tanınmaz olduğu hipokampus ile ilk dilim atın. DG kaldırmak için, ilk dilimlerden hipokampus izole ve DG çevresindeki sınırları görselleştirmek için mikroskop yeniden odaklama. DG hasat için, DG ve CA1 bölge arasında bir kesim yapmak için forceps kullanın ve DG ve CA3 bölge arasında dikey bir kesim izledi. Sonra fimbria ve herhangi bir komşu doku kaldırmak ve antibiyotik takviyeLI HBSS çözüm ayrı tüp içine hasat doku yerleştirin.
SVZ ve DG örneklerini ayırmak için, 37 santigrat derecede yaklaşık 50 dakikalık bir kuluçka için her tüpe HBSS'de %5-10 oranında ki Trypsin-EDTA%5-10'luk son konsantrasyona Trypsin-EDTA%0,05 ekleyin. Tripsin veya çok uzun kuluçka süresinin tüm kullanımı hücre ölümünün artmasına yol açarak hücre büyümesini olumsuz etkileyebilir. Doku birlikte kümelenmiş olduğunda, yıkama başına taze takviyeLI HBSS bir mililitre ile dört ardışık yıkama için enzim çözeltisi değiştirin.
Son yıkamadan sonra, serumsuz orta bir mililitre sindirilmiş dokular epidermal büyüme faktörü mililitre başına 10 nanogram ve tüp başına temel fibroblast büyüme faktörü mililitre başına beş nanogram ile takviye. Daha sonra homojen bir hücre çözeltisi elde edilene kadar p1000 pipet ile 7-10 kez hafif pipetleme ile dokuları mekanik olarak ayrıştırın. Ayrıştırılmış DG veya SVG hücresinin yoğunluğunu belirlemek için, her süspansiyondaki hücreleri hematositometrede sayın.
Nörosferler içine hücreleri genişletmek için, büyüme faktörleri ile desteklenen serum içermeyen ortamda mililitre yoğunluğu başına dördüncü hücrelere iki kez on bireysel hücre popülasyonları seyreltmek ve kaplanmamış içine hücre süspansiyon beş mililitre tohum 60 milimetre çapında Petri yemekleri. Daha sonra SVZ hücrelerini altı ila sekiz gün, DG hücrelerini ise primer nörosfer oluşumu için 37 derece santigrat derecede 10 ila 12 gün kuluçkaya yatırın. Nörosferlerin çoğunluğu 150 ila 200 mikrometre çapa sahip olduğunda, kültürlerden hücre süspansiyon hasat ve santrifüj ile nörosferler toplamak.
Başka bir santrifüj ile hücreleri toplamadan önce üreticinin talimatlarına göre bir fare kimyasal dissociation kiti ile nörosfer palet resuspend. Supernatant'ı büyüme faktörleri ile desteklenen bir mililitre serumsuz ortamla değiştirin ve peleti yaklaşık 10 kez hafifçe derecelendirmeye çalışın. Gösterildiği gibi ayrıştırılmış nöro hücreleri saymak ve serum içermeyen ortamda mililitre yoğunluğu başına dördüncü hücrelere iki kez 10 hücreleri reseed yeni içine büyüme faktörleri ile takviye 60 mililitre Petri yemekleri.
Daha sonra hücreyi hücre kültürünün kuluçka makinesine geri döndürün ve ikincil nörosferleri elde etmek için 6 ila 8 veya 10 ila 12 gün daha geçirin. Nörosfer testi kullanılarak elde edilen SVG ve DG nörosferleri farklılaşmamış Sox2 pozitif, nestin pozitif hücrelerden oluşur. Özellikle, SVG türetilmiş nörosferler Onların DG meslektaşlarına göre daha büyük boyutlara sahip.
Daha da önemlisi, farklılaşma koşullarında, SVG ve DG kaynaklı nöral kök/progenitor hücreleri nörosferlerin dışına göç ederek bir hücre pseudomonolayer oluştururlar. Her iki nörojenik bölgede de Sox2 çift pozitif, nestin çift pozitif, çift kortinin çift negatif hücre çiftlerinin varlığını, kendini yenilemeye işaret eden simetrik bölünmelere karşılık gelen gözönünde bulundurabilir. Hücre çiftleri içinde hangi Sox2 pozitif bir hücre, nestin pozitif, ve doublecortin negatif, ve diğer hücre Sox2 negatif, nestin negatif, ve doublecortin pozitif asimetrik bölünmeler gösteren.
Ve Sox2 çift negatif, nestin çift negatif, ve çift cortin çift pozitif hücre çiftleri simetrik bölünmelere karşılık gelen farklılaşmayı gösterir. Genel olarak, geçiş in vitro ikinci gün hücre ölüm oranını değiştirir. Neuritogenez, farklılaşmanın başlangıcında SVG ve DG nöral kök/progenitor hücrelerinin farklılaşmasından elde edilen nöronlarda değerlendirilebilir.
Görüldüğü gibi, nöritlerin uzunluğu ve sonucu farklılaşma ile artar. SVG'de DG'ye göre yüksek oranda proliferatif hücre yüzdesi gözlenmektedir. Olgun nöronların farklılaşmasına rağmen çoğalan ataların yüzdesi her iki nörojenik nişlerde de benzerdir. Her iki hücre tipi de olgunlaşmamış nöronlar, olgun nötronlar, oligodendrocytes öncühücreleri, olgun oligodendrocytes ve astrositler ayırt edebiliyoruz.
Nörosferler elde ettikten sonra, nöral kök/progenitör hücrelerinin köklüğünü ve çok yönlülüğünü incelemek için immünositokimya, kalsiyum görüntüleme, Batı lekeleri ve RT-PCR gibi çeşitli yöntemler uygulanabilir. Nörosfer tsay daha moleküler ve hücresel süreçleri hem çoğalması ve nöral kök / progenitor hücrelerinin farklılaşması dahil değerlendirmek için genetik ve hastalık modelleri uygulanabilir.
