בדיקת הנוירוספרה שימושית בטכניקת חוץ-חוץ-גוף לחקר המאפיינים הטבועים בתאי גזע/גוף עצביים, כולל התפשטות, התחדשות עצמית ורב-פוטנציה הן בהקשר הפיזיולוגי והן בהקשר הפתולוגי. בשל המבנה התלת מימדי שלה, טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לחקר נוירוגנזה למבוגרים. זה גם שימושי עבור culturing וקבלת תשואות גבוהות יותר של גזע עצבי / תאים מולדים.
בדיקה נוירוספרית זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של הפרעות מוחיות כגון אלצהיימר ומחלות פרקינסון או טרשת נפוצה. נוירוספרות ניתן להשיג גם מאזורים אחרים במוח או מערכות, כגון רקמת שומן או המעיים. מדגימה את ההליך עם פיליפה ריבירו תהיה ריטה סוארס, דוקטורנטית בקבוצה שלי.
כדי לקצור את היום שלאחר הלידה מוח אחד עד שלושה עכברים, החזק את החלק הגחוני של הגוף בבסיס הראש ולהשתמש במספריים מחודדים קטנים כדי לבצע חתך קו האמצע בעור לאורך כל הראש כדי לחשוף את הגולגולת. בצע חתך אורך בבסיס הגולגולת ולהמשיך לחתוך לאורך התפר sagittal בזווית רדודה ככל האפשר, כדי למנוע פגיעה במבני המוח. השתמש במקלפים מעוקלים כדי לקלף את הגולגולת לצדדים כדי לחשוף את המוח ולהחליק מרית קטנה מתחת למוח כדי לחתוך את עצבי הגולגולת וכלי הדם המחוברים לבסיס המוח.
מניחים את המוח לתוך צלחת פטרי של HBSS קר בתוספת אנטיביוטיקה ומ מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה נמוכה. מקם את המוח על פני הגב שלו. תוך החזקת המוח על ידי המוח הקטן, להשתמש במטסים עדין כדי להסיר קרום המוח מהצד הגחוני של המוח ואת נורות הריח.
לסובב את המוח על ההיבט הגחוני לקלף את שאר קרום המוח. לאחר מכן השתמש במקלות כדי להסיר את המוח הקטן ולהשתמש בממטרים מחודדים מעוגלים כדי להעביר את המוח על פיסת נייר מסנן עם נקבובית 11 מיקרומטר על גבי מסוק רקמות. למיקרו-דיסקטקט SVZ ו-DG, יש להתחיל בחיתוך המוח ל-450 מיקרומטר קורונה.
השתמשו בלמינה רטובה כדי לאסוף את המוח החתוך לתוך צלחת פטרי חדשה מלאה באנטיביוטיקה קרה בתוספת HBSS תחת מיקרוסקופ מנתח ולהשתמש במקלות כדי להפריד פרוסות קורונאליות בצורה חזיתית לחלק האחורי עד להגיע לפרוסות עם החדרים הצידיים. השתמש מטליות עדין לחתוך את השכבה הדקה של הרקמות המקיפות את הקיר הרוחבי של החדרים, למעט parenchyma striatal ואת כפיס המוח קורפוס ולמקם קצה אחד של המדפים מיד מתחת כפיס המוח והשני לתוך הרקמה מיד סמוך לאזור הגחוני של הגחון הרוחבי כדי לבודד את SVZ. חותכים קו קטן של רקמות המקיפות את החדר הצלבי ולאסוף את הרקמה נותחת לתוך צינור מדגם המכיל פתרון HBSS בתוספת.
כאשר כל הפרוסות כבר microdissected עם מטלפים היווצרות ההיפוקמפוס כבר הגיע, להשליך את הפרוסה הראשונה עם ההיפוקמפוס שבו DG הוא עדיין בלתי מזוהה. כדי להסיר את ה- DG, תחילה לבודד את ההיפוקמפוס מהפרוסות ולמקד מחדש את המיקרוסקופ כדי לדמיין את הגבולות סביב DG. כדי לקצור את ה- DG, השתמש במדפים כדי לבצע חתך בין אזור DG ו- CA1 ואחריו חתך אנכי בין אזור DG ו- CA3. לאחר מכן להסיר את פימבריה וכל רקמה סמוכה ולמקום את הרקמה שנקטפה לתוך צינור נפרד של פתרון HBSS בתוספת אנטיביוטיקה.
כדי לנטרל את דגימות SVZ ו- DG, הוסף טריפסין-EDTA 0.05% לריכוז סופי של 5-10% של טריפסין-EDTA 0.05% ב HBSS לכל צינור עבור דגירה של כ 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כל השימוש טריפסין או זמן דגירה ארוך מדי יכול להוביל למוות מוגבר של תאים, להשפיע לרעה על צמיחת התא. כאשר הרקמה יש גושים יחד, להחליף את פתרון האנזים במשך ארבע שטיפות רצופות עם מיליליטר אחד של HBSS בתוספת טריים לכל לשטוף.
לאחר הכביסה האחרונה, יש לעכל מחדש את הרקמות המתעכלות במיליליטר אחד של מדיום נטול סרום בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה אפידרמלי וחמישה ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה פיברובלסט בסיסי לכל צינור. ואז מכנית לנתק את הרקמות עם צינורות עדינים שבע עד 10 פעמים עם צינור P1000 עד פתרון תא הומוגני הושג. כדי לקבוע את הצפיפות של תא DG או SVG דיסוציאציה, לספור את התאים בכל השעיה על המטוציטומטר.
כדי להרחיב את התאים לנוירוספרות, לדלל את אוכלוסיות התאים הבודדים במהירות של פי 10 עד לתאים הרביעיים לצפיפות מיליליטר במדיום נטול סרום בתוספת גורמי גדילה וזרע חמישה מיליליטר של מתלי התא לתוך צלחות פטרי בקוטר 60 מילימטר לא צותת. לאחר מכן הדגירה את תאי SVZ במשך שישה עד שמונה ימים ואת תאי DG במשך 10 עד 12 ימים ב 37 מעלות צלזיוס להיווצרות נוירוספרה ראשונית. כאשר רוב הנוירוספרות יש 150 עד 200 קוטר מיקרומטר, לקצור את ההשעיה התא מן התרבויות ולאסוף את הנוירוספרות על ידי צנטריפוגה.
תן מחדש את משטח הנוירוספרה עם ערכת ניתוק כימית של העכבר בהתאם להוראות היצרן לפני איסוף התאים עם צנטריפוגה אחרת. החלף את supernatant עם מיליליטר אחד של מדיום ללא סרום בתוספת גורמי גדילה בעדינות לנסות לדרג את גלולה על 10 פעמים. לספור את תאי נוירו ניתק כפי שהודגם ו reseed את התאים פעמיים 10 לתאים הרביעית לכל צפיפות מיליליטר במדיום ללא סרום בתוספת גורמי גדילה לתוך חדש 60 מיליליטר פטרי מנות.
לאחר מכן להחזיר את התא לאנקובטור תרבות התא במשך שישה עד שמונה או 10 עד 12 ימים נוספים בהתאם לצורך כדי לקבל נוירוספרות משניות. נוירוספרות SVG ו- DG המתקבלות באמצעות בדיקה נוירוספרית מורכבות תאים חיוביים לא מו מופקים Sox2, קינון חיובי. יש לציין, נוירוספרות נגזר SVG יש ממדים גדולים יותר מאשר עמיתיהם DG שלהם.
חשוב לציין, בתנאי התבולל, SVG ו DG נגזר גזע עצבי / פגיונרים תאים נודדים מתוך הנוירוספרות, ויוצרים pseudomonolayer של תאים. בשני האזורים הנוירוגניים, ניתן לראות את נוכחותם של Sox2 חיובי כפול, נקין כפול חיובי, כפולקורטין כפול תאים שליליים זוגות תואמים חלוקות סימטריות המעידות על התחדשות עצמית. תאי התאים שבהם תא אחד של Sox2 חיובי, נקין חיובי, ו כפולקורטין שלילי, והתא השני Sox2 שלילי, נקין שלילי, ו כפולקורטין חיובי מדגים חלוקות אסימטריות.
וסוקס2 שלילי כפול, נקין שלילי כפול, וזוגות תאים חיוביים כפולים המתאימים לחלוקות סימטריות המעידות על בידול. בסך הכל, מעבר משנה את שיעור התמותה של התאים ביום השני במבחנה. Neuritogenesis ניתן להעריך נוירונים המתקבלים ההידור של SVG ו DG גזע עצבי / תאים מולדים בתחילת ההידור.
כפי שנצפה, האורך וההשלכות של neurites עולה עם ההידול. אחוז גבוה של תאים שגשוג נצפתה SVG לעומת DG. למרות שאחוז המופתים המתרבים המבדילים לנוירונים בוגרים דומה בשתי הנישות הנוירוגניות. שני סוגי התאים מסוגלים גם להתבדל לנוירונים לא בוגרים, נייטרונים בוגרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים, אוליגודנדרוציטים בוגרים ואסטרוציטים.
לאחר קבלת הנוירוספרות, ניתן לבצע מספר שיטות הכוללות אימונוציטוכימיה, הדמיית סידן, כתמים מערביים ו- RT-PCR כדי לחקור את הגבעול ואת הרב-פוטנציה של תאי הגזע העצבי/האב. ניתן ליישם את הבדיקות הנוירוספריות על מודלים גנטיים ומחלות כדי להעריך עוד יותר את התהליכים המולקולריים והתאיים הכרוכים הן בהתפשטות והן בהידול של תאי גזע עצביים/ סניטריים.
