Der Neurosphären-Assay ist eine nützliche In-vitro-Technik zur Untersuchung der inhärenten Eigenschaften von neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen einschließlich Proliferation, Selbsterneuerung und Multipotenz im physiologischen und pathologischen Kontext. Aufgrund seiner dreidimensionalen Struktur ist diese Technik ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der adulten Neurogenese. Es ist auch nützlich für die Kultivierung und Erlangung höherer Erträge von neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen.
Dieser Neurosphären-Assay kann auf die Untersuchung von Hirnerkrankungen wie Alzheimer und Parkinson oder Multiple Sklerose angewendet werden. Neurosphären können auch aus anderen Hirnregionen oder -systemen gewonnen werden, wie z. B. Fettgewebe oder darm. Das Verfahren mit Filipa Ribeiro demonstriert Rita Soares, eine Doktorandin in meiner Gruppe.
Um postnatale Tag eins bis drei Maus Gehirne zu ernten, halten Sie den ventralen Teil des Körpers an der Basis des Kopfes und verwenden kleine spitze Schere, um einen Mittellinienschnitt in der Haut über die gesamte Länge des Kopfes zu machen, um den Schädel zu belichten. Machen Sie einen Längsschnitt an der Schädelbasis und schneiden Sie die sagittale Naht in einem flachen Winkel wie möglich entlang, um eine Beschädigung der Gehirnstrukturen zu vermeiden. Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um den Schädel an den Seiten zu schälen, um das Gehirn freizulegen und einen kleinen Spachtel unter das Gehirn zu schieben, um die Hirnnerven und Blutgefäße zu schneiden, die mit der Basis des Gehirns verbunden sind.
Legen Sie das Gehirn in eine Petrischale von kalten HBSS mit Antibiotika ergänzt und legen Sie die Schale unter einem Sezieren Mikroskop bei geringer Vergrößerung. Positionieren Sie das Gehirn auf seiner dorsalen Oberfläche. Während halten das Gehirn durch das Kleinhirn, verwenden Sie feine Zange, um Meninges von der ventralen Seite des Gehirns und der olfaktorischen Glühbirnen zu entfernen.
Drehen Sie das Gehirn auf den ventralen Aspekt und schälen Sie den Rest der Hirnhaut ab. Dann verwenden Sie die Zange, um das Kleinhirn zu entfernen und verwenden Sie gekrümmte spitze Zangen, um das Gehirn auf ein Stück Filterpapier mit einer 11 Mikrometer Pore auf einem Gewebehäcksler zu übertragen. Für SVZ und DG Mikrodissektion, beginnen Sie mit dem Hacken des Gehirns in 450 Mikrometer koronale Abschnitte.
Verwenden Sie eine nasse Lamina, um das geschnittene Gehirn in eine neue Petrischale zu sammeln, die mit kaltem Antibiotikum gefüllt ist, ergänzt hbSS unter einem Sezierendes Mikroskop und verwenden Sie Zangen, um koronale Scheiben in einer anterior-zu-posterior Enden zu trennen, bis Scheiben mit den seitlichen Ventrikeln erreicht sind. Verwenden Sie feine Zangen, um die dünne Schicht des Gewebes, das die Seitenwand der Ventrikel umgibt, mit Ausnahme des striatalen Parenchyms und des Corpus callosum und legen Sie eine Spitze der Zange sofort unter den Corpus callosum und die andere in das Gewebe unmittelbar neben dem ventralen Bereich des lateralen Ventrikels, um das SVZ zu isolieren. Schneiden Sie eine kleine Linie von Geweben um den seitlichen Ventrikel und sammeln Sie das sezierte Gewebe in ein Probenröhrchen mit ergänzter HBSS-Lösung.
Wenn alle Scheiben mit Zangen mikroseziert sind und die Hippocampusbildung erreicht ist, entsorgen Sie die erste Scheibe mit Hippocampus, in der die DG noch nicht wiederzuerkennen ist. Um die DG zu entfernen, isolieren Sie zuerst den Hippocampus von den Scheiben und richten Sie das Mikroskop neu aus, um die Grenzen um DG herum zu visualisieren. Um die GD zu ernten, verwenden Sie Zangen, um einen Schnitt zwischen der DG und der CA1-Region zu machen, gefolgt von einem vertikalen Schnitt zwischen der GD und der CA3-Region. Dann entfernen Sie die Fimbria und alle angrenzenden Gewebe und legen Sie das geerntete Gewebe in separate Röhre von Antibiotikum ergänzt HBSS-Lösung.
Um die SVZ- und DG-Proben zu trennen, fügen Sie Trypsin-EDTA 0,05% zu einer Endkonzentration von 5-10% von Trypsin-EDTA 0,05% in HBSS zu jeder Röhre für eine etwa 50-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzu. Die gesamte Verwendung von Trypsin oder zu lange Inkubationszeit kann zu einem erhöhten Zelltod führen, was sich negativ auf das Zellwachstum auswirkt. Wenn das Gewebe zusammengepfercht ist, ersetzen Sie die Enzymlösung für vier aufeinander folgende Wäschen durch einen Milliliter frisch ergänzten HBSS pro Wäsche.
Nach der letzten Wäsche, setzen Sie das verdaute Gewebe in einem Milliliter serumfreies Medium ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter epidermalen Wachstumsfaktor und fünf Nanogramm pro Milliliter des grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktorprogramms pro Tube. Dann die Gewebe mit sanfter Pipettierung sieben- bis zehnmal mit einer P1000 Pipette mechanisch dissoziieren, bis eine homogene Zelllösung erhalten ist. Um die Dichte der dissoziierten DG- oder SVG-Zelle zu bestimmen, zählen Sie die Zellen in jeder Suspension auf einem Hämatozytometer.
Um die Zellen in Neurosphären zu erweitern, verdünnen Sie die einzelnen Zellpopulationen mit zwei mal zehn bis vier Zellen pro Milliliter Dichte in serumfreiem Medium, ergänzt mit Wachstumsfaktoren, und säen Sie fünf Milliliter der Zellsuspension in unbeschichtete Petrischalen mit 60 Millimeterdurchmesser. Dann inkubieren Sie die SVZ-Zellen für sechs bis acht Tage und die DG-Zellen für 10 bis 12 Tage bei 37 Grad Celsius für die primäre Neurosphärenbildung. Wenn die meisten Neurosphären 150 bis 200 Mikrometer Durchmesser haben, ernten Sie die Zellsuspension aus den Kulturen und sammeln Sie die Neurosphären durch Zentrifugation.
Setzen Sie die Neurosphärenpalette mit einem Maus-Chemikaliendissoziationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers aus, bevor Sie die Zellen mit einer anderen Zentrifugation sammeln. Ersetzen Sie den Überstand durch einen Milliliter serumfreies Medium, ergänzt durch Wachstumsfaktoren und versuchen Sie vorsichtig, das Pellet etwa 10 Mal zu bewerten. Zählen Sie die dissoziierten Neurozellen wie gezeigt und sät die Zellen bei zwei mal 10 bis die vierte Zelle pro Milliliter Dichte in serumfreiem Medium, ergänzt mit Wachstumsfaktoren, in neue 60 Milliliter Petrischalen.
Dann geben Sie die Zelle für weitere sechs bis acht oder 10 bis 12 Tage an den Zellkultur-Inkubator zurück, um sekundäre Neurosphären zu erhalten. SVG- und DG-Neurosphären, die mit dem Neurosphären-Assay gewonnen werden, bestehen aus undifferenzierten Sox2-positiven, nestinpositiven Zellen. Insbesondere sVG abgeleitete Neurosphären haben größere Dimensionen als ihre DG-Pendants.
Wichtig ist, dass unter Differenzierungsbedingungen SVG- und DG-abgeleitete neuronale Stamm-/Vorläuferzellen aus den Neurosphären wandern und eine Pseudomonoschicht von Zellen bilden. In beiden neurogenen Regionen ist es möglich, das Vorhandensein von Sox2 doppelpositiven, nestin doppelt positiven, Doublecortin-Doppelnegativzellenpaaren zu beobachten, die symmetrischen Teilungen entsprechen, die auf Selbsterneuerung hindeuten. Zellpaare, bei denen eine Zelle von Sox2 positiv, nestin positiv und doppeltkortin negativ ist, und die andere Zelle Sox2 negativ, nestin negativ und Doublecortin positiv zeigen asymmetrische Divisionen.
Und Sox2 Doppelnegativ, Nestin Doppelnegativ und Doublecortin doppel positive Zellpaare entsprechend symmetrischen Teilungen, die auf Differenzierung hinweisen. Insgesamt verändert Passaging die Zellsterblichkeitsrate am zweiten Tag in vitro. Die Neuritogenese kann in Neuronen untersucht werden, die aus der Differenzierung von SVG- und DG-Neuralstamm-/Vorläuferzellen zu Beginn der Differenzierung gewonnen werden.
Wie beobachtet, nimmt die Länge und Verzweigung der Neuriten mit der Differenzierung zu. Ein hoher Prozentsatz proliferativer Zellen wird bei SVG im Vergleich zu DG beobachtet. Obwohl der Prozentsatz der sich ausbreitenden Vorläufer, die sich in reife Neuronen differenzieren, in beiden neurogenen Nischen ähnlich ist. Beide Zelltypen sind auch in der Lage, in unreife Neuronen, reife Neutronen, Oligodendrozyten Vorläuferzellen, reife Oligodendrozyten und Astrozyten zu unterscheiden.
Nach Erhalt der Neurosphären können verschiedene Methoden wie Immunzytochemie, Kalziumbildgebung, Western Flecken und RT-PCR durchgeführt werden, um die Stammheit und die Multipotenz der neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen zu untersuchen. Der Neurosphären-Assay kann auf genetische und Krankheitsmodelle angewendet werden, um die molekularen und zellulären Prozesse weiter zu bewerten, die sowohl die Proliferation als auch die Differenzierung von neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen beinhalten.
