Bu biyokimyasal yöntem, uygun bir antikor mevcut olduğu beyinde ifade edilen herhangi bir membran proteininin palmitoylation durumunun belirlenmesini sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, yakınlık arınması gerektirmez ve bunun yerine ilgi bir protein in modifikasyon sayısını belirlemek için jel hareketlilik değişiklikleri kullanır. Beyin dışarı diseksiyon sonra, buz üzerinde bir cam homogenizer homojenizasyon tampon 10 mililitre hemen homojenize.
Yaklaşık 12 vuruş kullanarak, 1400 kez G ve dört derece santigrat 15 dakika lysates santrifüj. Supernatant'ı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. 10 mililitre homojenizasyon tamponunda peleti yeniden askıya alın.
Yaklaşık altı vuruş kullanarak homojenize edin. Süspansiyonu 710 kez G ve 4 santigrat derece 10 dakika santrifüj edin. Supernatants birleştirin ve 20 dakika boyunca 40, 000 kez G ve dört derece santigrat onları santrifüj.
Supernatant atın ve bir pipet ucu ile pelet kırarak ve yukarı ve aşağı pipetleme bir homojenizasyon tampon pelet membran fraksiyonu resuspend. Protein düzeylerini quantitate için ABCA tayini gerçekleştirin. APEGS tayini gerçekleştirmek için, 1,5 mililitrelik bir tüpe 470 mikrolitre tampon A yerleştirin ve yaklaşık 100 ila 200 miligram protein ekleyin.
Tüpü sonicate ve sonra 25 santigrat derece ve 10 dakika boyunca 13.000 kez G en az 13.000 kez gaz önsantrak tarafından çözünmez protein ayırın. Solubalize proteini yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. İlk olarak, 55 santigrat derecede 60 dakika boyunca TCEP 25 mikrolitre solubalize protein kuluçka ile disülfür bağları bozabilir.
Daha sonra, oda sıcaklığında üç saat boyunca NEM stok çözeltisinin 12,5 mikrolitre sistein ile inkübünle serbest sisteinları bloke edin. Sonra, kloroform metanol yağış süreci başlar. Protein çözeltisini 1,5 mililitrelik tüpten, sallanan kova rotorunda mütevazı bir hızda santrifüj edilebilen polipropilen veya cam tüpe aktarın.
Kısaca iki mililitre metanol ve girdap ekleyin. Kısaca bir mililitre kloroform ve girdap ekleyin. Sonra tekrar kısaca deiyonize su ve girdap 1,5 mililitre ekleyin.
Gerekirse, tam karıştırma sağlamak için tüp ters. Numuneleri 3000 kez G ve 25 santigrat derecede 30 dakika sallayarak kova rotorunda santrifüj edin. Çözeltinin üst fazını dikkatlice çıkarın ve bir tüpe atın.
Metanol 1.5 mililitre ekleyin. Opak protein gözleme parçalamak için dikkatli olmak, tüp nazik ters tarafından hafifçe ama iyice karıştırın. Numuneyi 3000 kez G ve 25 santigrat derecede 10 dakika sallayarak kova rotorunda santrifüj edin.
Cam serolojik pipet kullanarak, protein gözleme bozmadan mümkün olduğunca çözeltinin üst fazı kadar çıkarın. Peleti bir mililitre metanolle dikkatlice durulayın ve en az 10 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Kloroform metanol yağışı tamamlandığında, palmitoyl tiyoester bağlantılarının bölünmesine başlanın ve 125 mikrolitrelik tampon A.Transfer'deki protein çökeltisini yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın.
Tüpü kısa bir süre sonicate ve sonra 13, 000 kez G veya daha yüksek ve 25 derece santigrat 10 dakika çözünmez malzeme kaldırmak için santrifüj. Yeni 1.5 mililitre tüpler için solubalized protein aktarın ve tampon H veya tampon T.375 mikrolitre ekleyin.Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnekleri kuluçkasonra, kloroform metanol yağış tekrarlayın. Korumasız sisteinlara m-PEG eklemek için, peleti 10 mil veya daha fazla TCEP içeren 100 mikrolitre arabellek A'da yeniden sulayarak başlayın.
Daha sonra süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Stok m-PEG 5K çözeltisi 25 mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Sonunda dönüş üzerinde oda sıcaklığında kuluçka.
60 dakikalık kuluçkadan sonra, kloroform metanol çökeltisi tekrar gerçekleştirerek unincorporated m-PEG 5K çıkarın. 13,000 kez G ve 25 santigrat derece 10 dakika dan fazla santrifüj. Kalın, flocculent gözleme kaçınarak, daha önce olduğu gibi dikkatle üst faz kaldırın.
Metanol bir mililitre ekleyin ve yavaşça ama iyice karıştırın. 13,000 kez G ve 25 santigrat derece 10 dakika dan fazla santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve metanol bir mililitre ile pelet durun.
Yine, 13,000 kez G ve 25 derece santigrat derece 10 dakika dan fazla santrifüj. Pelet hava kurutultuktan sonra, TCEP veya herhangi bir azaltma maddesi olmadan tampon A 50 mikrolitre resuspend. BCA protein quantitation için çözeltinin 5 mikrolitre rezerv.
Nicel likten sonra, uygun miktarda 4x Laemmli örnek arabellek ekleyin. Örneği bir SDS sayfa jeline yükleyin. Batı lekeleme için standart ayırma aktarım ve algılama protokollerini kullanın.
SynDIG proteinlerinin palmitoylation durumunu araştırmak için, homojenize fare beyinlerinden P2 membran fraksiyonları APEGS tizine tabi tutuldu. Antikorlarla ayırma ve sondalama SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 ve Prrt2'nin fare beyninde palmitoylated olduğunu gösterdi. Kloroform metanol çökeltisinin amacı, NEM gibi bir kimyasalın protokolün bir sonraki adımına müdahale etmesini önlemektir.
Uygun bir kloroform metanol yağış protein kaybını en aza indirirken istenmeyen kimyasalları kaldıracaktır. Bu yöntem, palmitoylation'un mekansal-zamansal düzenlemelerini araştırmak için farklı yaşlardaki farelerden veya farklı beyin bölgelerinden gelen beyin lysates'lerine uygulanabilir.
