이러한 생화학적 방법은 적합한 항체가 가능한 뇌에서 발현되는 모든 멤브레인 단백질의 팔미토일화 상태를 판단할 수 있게 한다. 이 기술의 주요 장점은 친화성 정화를 필요로하지 않고 대신 관심있는 단백질의 수정 수를 결정하기 위해 젤 이동성의 변화를 활용한다는 것입니다. 뇌를 해부한 후, 얼음에 유리 균질화에 균질화 완충제의 10 밀리리터에서 즉시 균질화.
약 12스트로크를 사용하여 1400회 G에서 15분 동안, 섭씨 4도에서 15분간 용해를 원심분리합니다. 얼음에 새로운 튜브에 상체를 전송합니다. 균일화 완충제의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
약 6개의 스트로크를 사용하여 균질화하십시오. 서스펜션은 710배, 섭씨 4도에서 10분간 분리합니다. 수퍼나티와 원심분리기를 40, 000배, 섭씨 4도에서 20분간 결합합니다.
피펫 끝으로 펠릿을 분해하고 위아래로 파이펫을 하여 상체를 버리고 펠릿 막 분획을 균일화 버퍼에서 재연합니다. 단백질 수치를 양량화하기 위해 ABCA 분석기를 수행하십시오. APEGS 분석기를 수행하려면 버퍼 A 470 마이크로리터를 1.5 밀리리터 튜브에 넣고 약 100~200밀리그램의 단백질을 추가합니다.
튜브를 초음파 처리한 다음 튜브를 섭씨 25도, 최소 13, 000배 G에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 단백질을 분리합니다. 용해성 단백질을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 첫째, 55°C에서 60분 동안 TCEP의 25마이크로리터에서 용액화된 단백질을 배양하여 이황류 결합을 방해합니다.
그런 다음, 실온에서 3시간 동안 NEM의 스톡 용액의 12.5 마이크로리터로 용액을 배양하여 무료 시스테인을 차단합니다. 다음으로, 클로로폼 메탄올 강수량 과정을 시작합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 적당한 속도로 스윙 버킷 로터에서 원심분리될 수 있는 폴리프로필렌 또는 유리 튜브로 단백질 용액을 전달합니다.
메탄올과 소용돌이의 두 밀리리터를 간단히 넣습니다. 클로로폼과 소용돌이 1밀리리터를 짧게 넣습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터의 탈온된 물과 소용돌이를 다시 간략하게 추가합니다.
필요한 경우 튜브를 뒤집어 철저한 혼합을 보장합니다. 시료를 G 3000배, 섭씨 25도에서 30분간 스윙 버킷 로터에서 원심분리합니다. 조심스럽게 제거하고 튜브에서 용액의 상층을 폐기.
메탄올 1.5 밀리리터를 추가합니다. 튜브의 부드러운 반전으로 부드럽고 철저하게 섞어 불투명한 단백질 팬케이크를 조각하지 않도록 주의하십시오. 원심 분리는 스윙 버킷 로터에서 10 분 동안 3000 배 G 및 섭씨 25도에서 샘플을 원심 분리합니다.
유리 세로지 피펫을 사용하여 단백질 팬케이크를 방해하지 않고 가능한 한 많은 용액을 제거하십시오. 펠릿을 메탄올 1밀리리터로 조심스럽게 헹구고 10분 이상 건조시키세요. 클로로폼 메탄올 침전이 완료되면, 완충 A.Transfer의 125 마이크로리터에서 단백질 침전을 재중단하여 팔미토일 티오에스테르 연계의 분열을 시작한다.
튜브를 간략하게 초음파 처리한 다음 13, 000배 G 이상, 섭씨 25도에서 10분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거합니다. 용액화된 단백질을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 375마이크로리터의 완충 H 또는 버퍼 T.를 실온에서 60분 동안 배양한 후 클로로폼 메탄올 침전을 반복한다. 보호되지 않은 시스테인에 m-PEG를 추가하려면 10mil 이상을 포함하는 완충A의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하여 시작합니다.
그런 다음 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 스톡 m-PEG 5K 용액 25마이크로리터를 추가하고 파이펫팅으로 섞습니다. 끝 회전을 통해 끝과 실온에서 배양.
60분 간 인큐베이션을 한 후 클로로폼 메탄올 강수량을 다시 수행하여 통합되지 않은 m-PEG 5K를 제거합니다. 원심분리기는 13배, 000배, 섭씨 25도를 10분 이상 입니다. 두껍고 부풀어 있는 팬케이크를 피하면서 이전과 같이 상판을 조심스럽게 제거하십시오.
메탄올 1밀리리터를 넣고 부드럽고 철저하게 섞습니다. 원심분리기는 13배, 000배, 섭씨 25도를 10분 이상 입니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 메탄올 1 밀리리터로 펠릿을 헹구십시오.
다시 말하지만, 원심분리기는 13배, 000배, 섭씨 25도를 10분 동안 초과합니다. 펠릿을 공기 건조 후, TCEP 또는 환원 제없이 완충 A의 50 마이크로 리터로 다시 중단. BCA 단백질 수량에 대한 용액 의 5 마이크로 리터를 예약하십시오.
수량 후 적량의 4배 Laemmli 샘플 버퍼를 추가합니다. 샘플을 SDS 페이지 젤에 로드합니다. 서부 블로팅에 표준 분리 전송 및 감지 프로토콜을 사용합니다.
SynDIG 단백질의 팔미토일화 상태를 조사하기 위해 균질화된 마우스 뇌에서 P2 멤브레인 분획은 APEGS 분석기를 실시하였다. 항체와의 분리 및 프로빙은 SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 및 Prrt2가 마우스 뇌에서 팔미토이트된다는 것을 입증했습니다. 클로로폼 메탄올 침전의 목적은 NEM과 같은 하나의 화학 물질을 방지하여 프로토콜의 다음 단계를 방해하는 것입니다.
적절한 클로로폼 메탄올 강수량은 단백질 손실을 최소화하면서 바람직하지 않은 화학 물질을 제거합니다. 이 방법은 팔미토일화의 공간 측두체 규정을 조사하기 위해 다른 연령대의 마우스 또는 다른 뇌 영역에서 뇌 용액에 적용 할 수 있습니다.
