Peki bu protokol neden önemli? Beyin metastazlarının tedavisi çok zordur ve bu protokol minimal ekstrakraniyal tümörlerle klinik olarak ilgili bir fare modeli üretir. Bu teknik, intrakraniyal tümörlerden ilaç dağılımının ve yanıtının objektif analizini sağlar.
Bu tekniğin temel avantajı, modelin yüksek oranda tekrarlanabilir olması ve beyin metastazlarının enjeksiyondan sonra nispeten kısa bir sürede gelişmesidir. Hastalığın ilerlemesi hayvanlar arasında benzerdir ve araştırmacıların deneyleri, tedavi zaman çizelgelerini ve bitiş noktalarını standartlaştırmalarını kolaylaştırır. Yeni başlayanlar için tavsiyem, diseksiyon mikroskobundan bakarken forseps ve şırınga kullanmaları, boynun etrafındaki anatomik işaretlere aşina olmaları ve protokolü bir veteriner varlığında uygulamalarıdır.
BT-474 kanser hücrelerini, altı hücreye iki kez 10 tohumlama yoğunluğunda, hücreler enjeksiyondan önce% 70 ila% 80'lik bir akıcılığa ulaşana kadar 10 mililitre tam büyüme ortamı ve kültürü kullanarak bir T-75 şişesine tohumlayarak başlayın. Enjeksiyon gününde, büyüme ortamını atın ve hücre tek katmanını PBS ile iki kez yıkayın ve beş mililitre önceden ısıtılmış hücre kültürü ayrışma reaktifi ekleyin. Beş dakika boyunca veya hücreler ayrılana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin.
Beş dakika sonra, şişeyi inkübatörden çıkarın ve hücre ayrılmasına yardımcı olmak için hafifçe dokunun. Ayrışma reaktif aktivitesini söndürmek için% 10FBS içeren beş mililitre tam büyüme ortamı ekleyin. Hücre kümelerini azaltmak için pipetleme yaparak çözeltideki hücreleri nazikçe yeniden askıya alın.
Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 180 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı boşaltın ve hücre kümelenmesini en aza indirmek için hücre peletini kalsiyum ve magnezyum olmadan 10 mililitre HBSSS'de yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 180 G'de santrifüj edin Artık serum veya ayrışma reaktifini çıkarmak ve hücre peletini üç mililitre HBSS'de yeniden askıya almak için süpernatantı boşaltın.
50 mililitrelik taze bir konik tüp üzerine 100 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirin ve hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu geçirin. Tripan mavisi kullanarak canlı hücrelerin sayısını hesaplayın ve HBSS ile hücre süspansiyonunu, mililitre başına altı hücreye 2.5 çarpı 10'luk bir hücre konsantrasyonuna seyreltin. Tüpü buz üzerinde yatay tutun ve kümelenmeyi en aza indirmek için tüpü periyodik olarak hafifçe sallayın.
Hücre süspansiyonu en fazla altı saat boyunca buz üzerinde saklanabilir. Tanımlama için kulak delme faresi ve kürkü boyun bölgesinden tıraş etmek için elektrikli makaslar kullanın. Fazla saçları bant kullanarak maruz kalan ciltten temizleyin.
Kurumayı önlemek için gözlere oküler kayganlaştırıcı uygulayın. Cerrahi tahtaya bantlanmış ipliği kullanarak üst kesici dişleri bağlayarak fareyi nazikçe sabitleyin, ardından ön ve arka bacakları bantlayın. Bu adım vücudu uzatır ve işlem sırasında boynu düz tutar.
Ameliyat öncesi cilt hazırlığı için, cilt mikroflorası yükünü azaltmak ve gevşek saçları çıkarmak için boynu povidon iyot gibi topikal bir antiseptik ile silin. Cildin merkezinden temizleyin, kesi yerinin yeniden kirlenmesini önlemek için dışa doğru çalışın. İşlemi% 70 etanol kullanarak tekrarlayın ve dezenfeksiyon için üç alternatif iyot ve etanol turu gerçekleştirin.
Prosedüre devam etmeden önce anestezi ölümünü sağlamak için çimdik testi ile refleks kontrolü yapın. Hayvanın üzerine steril bir cerrahi örtü koyun. Diseksiyon mikroskobu altında, çenenin beş milimetre altından torasik girişe kadar makas kullanarak farenin boyun bölgesindeki orta hat boyunca dikey 15 milimetrelik bir kesi yapın.
İki çift açılı forseps kullanarak, cildi ve altta yatan tükürük bezlerini ayırın ve trakeayı maruz tutmak için retraktörler uygulayın. İki çift ince açılı forseps kullanarak, sağ karotis kılıfını ortaya çıkarmak için trakeaya bitişik kas ve yağ dokusunu açıkça diseke edin. Karotis kılıfı, ortak karotis arter, ven ve vagus sinirini kaplayan fibröz tabakadır ve bu demet parlak kırmızı ortak karotis arter tarafından görselleştirilebilir.
Ortak karotis arter kaudalinin bir segmentini, çevreleyen fasyanın karotis bifurkasyonuna temizleyin ve vagus siniri ve damarlarından ayırın. Karotis bifurkasyonunu çevreleyen sinirlerden ve fasyadan izole edin ve temizleyin. İnce forsepsleri eksternal karotis arterin altına yerleştirin ve arterin altına 5-0 ipek sütür geçirin.
Dikişi düğümleyin ve sıkın ve fazla çizgiyi kesin. İnce forsepsleri ortak karotis arterin altına yerleştirin ve arterin altına 5-0 ipek sütür geçirin. Bir düğüm bağlayın ve sütürü önerilen enjeksiyon bölgesine yakın bir konumda sıkın.
Fazla dikişi kesin, çizginin yaklaşık 10 milimetresini bırakın. Düşük tiftikli tek kullanımlık sileceklerden oluşan bir şeridi yaklaşık 10 x 5 milimetre kesin ve nemlendirin. Şeridi katlayın ve önerilen enjeksiyon bölgesinde karotis arterin altına yerleştirin.
Bu, enjeksiyon sırasında damarı destekleyecektir. Önerilen enjeksiyon bölgesine ortak karotis arter rostralinde, gevşek bir düğüm ile üçüncü bir ligasyon yerleştirin. Bu sadece enjeksiyondan sonra sıkılır.
Hücre süspansiyonunu nazikçe çalkalayın ve 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu 31 gauge iğneli bir insülin şırıngasına çekin. Şırıngayı etkinleştirici bir ayak pedalına bağlı şırınga sürücüsüne yükleyin. Şırıngaya 31 gauge iğneli ince bir kanül takın ve hattı astarlayın.
Karotis arterin iyi konumlandırılmış ve basınçlı olup olmadığını kontrol edin. Biri ilk ligatürün ucuna hafifçe gerilen ve diğeri 31 gauge iğneyi tutan iki ince açılı forseps kullanarak, iğneyi eğimli olarak yavaşça kan damarının lümenine yerleştirin ve delinmemeye dikkat edin. Daha önce hazırlanan 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu, ortak karotis artere saniyede 10 mikrolitrede yavaşça enjekte edin.
Bu, beşinci hücrelere kan damarına 2,5 kat 10 verecektir. Başarılı enjeksiyon, karotis kan damarından kanın temizlenmesiyle görselleştirilebilir. Geri akışı ve kanamayı önlemek için iğneyi çektikten hemen sonra gevşek bağı yavaşça kaldırın ve sıkın.
Fazla dikişleri kesin ve nemlendirilmiş düşük tiftikli tek kullanımlık sileceklerin parçasını çıkarın. Bir P-200 pipet kullanarak, cerrahi boşluğu 150 ila 200 mikrolitre steril su veya salin ile iki kez durulayın. Kanamaları kontrol ettikten sonra, yumuşak dokuyu, tükürük bezlerini ve cildi karotis arter ve trakea üzerinde yeniden konumlandırın.
Kesinin cilt tabakasını bir dikiş iğnesi tutucu, forseps ve emilebilir veya emilemeyen 6-0 monofilament sütür kullanarak sürekli bir düzende kapatın. Ameliyat sonrası ağrı kesici olarak deri altı enjeksiyonu yoluyla kilogram buprenorfin başına 50 mikrogram ve kilogram başına bir miligram meloksikam enjekte edin. Anesteziden kurtulmak için hayvanı sıcak ve temiz bir kafese taşıyın.
Lektin, farelerin ortak karotis arterine, eksternal karotis arter ligasyonu ile veya eksternal karotis arter ligasyonu olmadan enjekte edildi. Dış karotis arter bağlandığında yanak dokularında lektinde bir azalma gözlendi. Sonuçlar, ligasyonun beyin doğumunu etkilemediğini gösterdi.
Tümör progresyonu, lusiferaz eksprese eden, HER2 ile güçlendirilmiş meme kanseri hücre hattı kullanılarak izlendi. BT474 beyin metastazı modeli, internal karotis enjeksiyonu sonrası beşinci haftadan itibaren biyolüminesan sinyallerde bir artış gösterdi ve bundan sonra kademeli olarak büyüdü. Beş ila sekiz hafta arasında, heterojen sinyal yoğunluğu, kompleks sıvı perfüzyonu olan bir intrakraniyal tümöre işaret etti.
Tümör bölgesindeki gadolinyum konsantrasyonu, kan dolaşımından tümör dokusuna sızdığı için artmıştır. Nanotıp ve beyin metastazlarının birikmesi, BT-474 farelerinde, tümör bölgesinde tespit edilen daha yüksek nanotıp seviyeleriyle, dahil olmayan beyin bölgelerine kıyasla doğrulanmıştır. BT-474 beyin metastazı modeli ilerledikçe, hayvanlar% 20'ye kadar vücut ağırlığını kaybetmeye başladı ve bu da enjeksiyondan dokuz hafta sonra medyan hayatta kalma süresini yaptı.
Histoloji sonuçları, tümörlerin tek taraflı olarak yerleştirildiğini ve tümörlerin çoğunlukla katı, yalnız kitleler olarak göründüğü karotis enjeksiyon bölgesi ile eşleştiğini göstermiştir. Boş alanların cepleri sıklıkla gözlendi ve nekrotik hücrelerden oluşurken, bazı hayvanlarda daha küçük çıkıntılar da mevcuttu. Protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, iğneyi yerleştirmeden önce karotis arteri doğru bir şekilde hazırlamak ve konumlandırmak ve daha sonra iğnenin yerleştirilmesi sırasında uygun gerginliği uygulamaktır.
Bu model, beyne ilaç dağıtımını ve beyin metastazının tedavisi için yeni terapötiklerin etkinliğini araştıran araştırmacılar için yararlıdır.
