Araştırmamız, ateroskleroz ilerlemesinde sinir sisteminin rolünü anlamaya odaklanmaktadır. Spesifik olarak, sırt ile her etkileşimde, ateroskleroz sırasında sinirin nasıl değiştiğini ve etkileşiminin hastalığın ilerlemesini nasıl etkilediğini cevaplamayı amaçlıyoruz. Hastalık mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirmek için ateroskleroz araştırmalarını ilerletmek için şu anda çeşitli son teknolojiler kullanılmaktadır.
Bunlar arasında doku temizleme ve 3D görüntüleme, gelişmiş mikroskobik teknikler, yapay zeka, tek hücre dizileme ve makine öğrenimi yer alır. Ateroskleroz ilerlemesi sırasında, arteriyel duvar bileşenleri sağlam bir yeniden yapılanmaya uğrar. Sağlam dokuların 3D ve yüksek çözünürlüklü görüntülenmesindeki değişikliklerin tanımlanması temel deneysel zorluklardır.
Burada açıklanan görüntüleme araçları, araştırmacıların ve kardiyologların hastalığı daha iyi anlamalarına ve sonunda hastaların tedavisine yardımcı olacaktır. Burada açıklanan protokol, sağlam dokuların derin doku görüntülemesi ve başka türlü erişilemeyen yapılarının görselleştirilmesi gibi geleneksel tekniklere göre çeşitli avantajlar sunar. Bu protokoller, hastalığın ilerlemesinin anlaşılmasını geliştirmek için hücre-hücre ve hücre-doku etkileşiminin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Sağlam dokudaki hücresel ve yapısal değişiklikleri 3D olarak görselleştirmek, kardiyovasküler araştırmalarda cevaplanmamış biyolojik soruları daha iyi anlamak için yeni bilgiler sağlayabilir. Başlamak için, anestezi uygulanmış fareyi cerrahi kağıt havlularla kaplı bir köpük tabağa yerleştirin. Yapışkan bantlar kullanarak farenin kollarını ve bacaklarını sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
Göğsü% 75 etanol ile dezenfekte edin. Bir mililitrelik tek kullanımlık şırınga kullanarak sol ventrikülden kanı toplayın. Daha sonra göğüste orta hat kesisi ve sağ kulakçıkta küçük bir kesi yapın.
Farenin sol ventrikülünü, kan akılana kadar beş dakika boyunca PBS'de 10 mililitre beş milimolar EDTA ile perfüze edin, ardından 5 ila 10 dakika boyunca 20 mililitre PBS uygulayın. Son olarak, 10 mililitre% 4 paraformaldehit ile 20 dakika boyunca perfüze edin. Diseksiyon stereo mikroskobu altında, gastrointestinal ve üreme organları da dahil olmak üzere iç organları çıkarın.
Kalbi, aortu ve böbrekleri sağlam bırakın. Ardından timusu ve çevresindeki yağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Çıkan aorttan iliak bifurkasyona kadar tüm aortu açığa çıkarın.
Tüm aortu hasat edin ve PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. Aortu farklı segmentlere ayırın ve iki 2, 2'Thiodiethanol veya TDE temizliği için uzunlamasına bölün. Uç yüz aortunu Y şeklinde düz siyah bir balmumu plakasına sabitleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede %4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
Ertesi gün, aortu çıkarın ve beş dakikalık bir yıkama için PBS'ye aktarın. Daha sonra aortu blokaj ve geçirgenlik için iki saat boyunca bir blokaj çözeltisine aktarın. Daha sonra, aortu 24 saat boyunca bloke edici solüsyondaki primer antikorlarla inkübe edin.
Aortu PBS'de beş dakika boyunca yıkayın, gece boyunca% 10 normal eşek serumu ve nükleer boyama için DAPI'de ikincil antikorlarla inkübe etmeden önce beş kez tekrarlayın, Lekeli aortu artan TDE çözeltisi konsantrasyonuna aktarın. Ardından, çift taraflı yapışkan dikdörtgen görüntüleme ara parçasını temiz bir cam slayta iyice yapıştırın ve temizlenmiş aortu aktarın, böylece uç yüz aort adventitinin kapak kaymasına baktığından emin olun. Aortu %60 TDE solüsyonu damlalarıyla monte edin ve hava kabarcıklarını önleyerek dikkatlice bir kapak fişi takın.
20x yağa daldırma objektifi ile donatılmış ters konfokal lazer tarama mikroskobunu açın. Hibrit diyot dedektörlerini leke boyalarına göre ayarlayın. Görüntü ayarlarını yapın ve görüntüleme için 1024x1024 piksel XY formatını seçin.
Daldırma yağını kapak kızağına damlatın ve 63x objektifi, daldırma yağına ve kapak kızağına temas edene kadar kaba bir şekilde s'ye doğru hareket ettirin. Daha sonra ilgilenilen bölgeyi belirleyin ve üç boyutlu görüntüleme için 60 mikrometre derinliğe kadar iki ila dört mikrometre adım boyutunda uç yüz aortunun adventitia tarafından Z-yığınları elde edin. Dosyayı örnek ayrıntıları ve tarama ayrıntılarını içeren bir ad verin ve verileri kaydedin.
20x objektif ile donatılmış dik bir çoklu foton mikroskobu kullanarak, abluminal taraftan 10 ila 15 mikrometre adım boyutunda 700 mikrometre derinliğe kadar Z-yığınları elde edin. Fareyi PBS ve paraformaldehit ile uyuşturduktan ve perfüze ettikten sonra, vücut kısmını diyafram seviyesinin üzerinde inceleyin. Vücudun alt kısmını %4 paraformaldehit ile dört santigrat derecede bir ila iki gün sabitleyin.
Daha sonra, numuneyi PBS'de 10 dakika boyunca iyice yıkayın ve üç kez tekrarlayın. Numuneyi 48 saat boyunca% 20 kübik çözelti içinde inkübe edin. PBS ile yıkadıktan sonra, geçirgenlik ve blokaj için numuneyi gece boyunca PGST solüsyonunda inkübe edin.
Ertesi gün, numuneyi PGST çözeltisinde birincil antikorlarla dört santigrat derecede 10 ila 12 gün boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Numuneyi PGST'de yıkadıktan sonra, yedi gün boyunca dört santigrat derecede PGST'de DAPI'ye ikincil antikorlar ekleyin. Numuneyi PGST'de bir saat boyunca beş kez tekrarlayarak iyice yıkayın.
Lekeli numuneyi, konsantrasyon başına 12 saat inkübe ederek, dehidrasyon için bir dizi artan konsantrasyonda tetrahidrofuran çalışma solüsyonuna aktarın. Dehidrasyondan sonra, numuneyi lipidin uzaklaştırılması için üç saat boyunca mutlak bir diklorometan çözeltisine yerleştirin. Daha sonra, numuneyi üç ila altı saat boyunca benzil alkol benzil benzoat çözeltisi ile eşleşen bir kırılma indisi içinde inkübe edin.
Başlamak için, fare, aort ve alt vücut kısmı görüntülerinin Z yığını döşemeli görüntülerini görüntü işleme iş istasyonuna yükleyin. Bir hücrenin veya yapının hacim derinliğini renk kodlaması yapmak için, ham görüntüyü çözmek için görüntü geri yükleme yazılımı kullanın. Fiji yazılımında, zamansal renk kodlaması kullanarak evrişimden arındırılmış verilerin maksimum yoğunluk projeksiyonunu oluşturun.
Z yığını döşemeli TIFF görüntü serisini yazılıma yükleyin. Fiji dikiş eklentisini kullanarak görüntüleri dikin ve TIFF formatında kaydedin. Ardından, dikişli görüntüleri görüntü segmentasyonu için üç boyutlu görselleştirme yazılımına yükleyin.
X-Y-Z eksenindeki nöronal yapıları, aort ve gangliyonlar arasındaki tüm yol boyunca manuel olarak izleyin. Önceden işlenmiş görüntüleri görüntü analiz yazılımına yükleyin. Aort ve bağ dokularını segmentlere ayırmak için otofloresan kullanın.
Farklı aort duvarını ve plağını görselleştirmek için ayrı sahte renkler uygulayın. Son olarak, işlenen görüntülerin arka planı üzerindeki yerel kontrastı geliştirmek için kontrast sınırlı uyarlanabilir histogram eşitleme işlevini kullanın. TDE ile temizlenmiş aterosklerotik aort, arteriyel tersiyer lenfoid organlarda NF200 ile boyanmış sinir liflerinin geniş bir neogenezi olan plaklarda CD3e ile boyanmış T hücrelerini ortaya çıkardı.
APOE nakavt farelerde hastalıklı abdominal aortun çoklu foton görüntülemesi, arter üçüncül lenfoid organlar içinde B220 pozitif B hücrelerinin bulunmadığı bölgelerde NF200 eksprese eden akson filizlenmesini gösterdi. iDISCO ile temizlenmiş fare karnının ışık tabakası görüntülemesi, aterosklerotik plağa bitişik adventitiada yeni oluşan NF200 ile boyanmış aksonlar ile aort ve sempatik ganglionlar arasındaki uzamsal ilişkiyi görselleştirdi.
