Tirozin fosfataz SHP2, hücresel sinyal önemli bir aracı, hücre sağkalım ve çoğalması teşvik. Ekibim kanser tedavisi için küçük molekül SHP2 inhibitörleri bulmaya odaklanmıştır. Tekniğimiz hücre-penetrants kurmak için hızlı ve güçlü bir yöntem sağlar, hem de küçük molekül SHP2 inhibitörleri hedef nişan, hücrelerde.
Bu, keşif kaynaklarının verimli bir şekilde yönlendirilen bir şekilde yönlendirilen bir garantidir. Kanser tedavisi için cazip bir hedef olarak SHP2. Ve birkaç SHP2 inhibitörleri, klinik çalışmalarda bulunmaktadır.
Geliştirilmiş etkinlik profilleri ile yeni nesil inhibitörleri keşfini kolaylaştırmak için tekniğimiz. Prosedürü gösteren Celeste Romero, bir araştırma asistanı ve Douglas Sheffler, bir araştırma yardımcı doçent, bizim laboratuvar dan olacaktır. HEK293 T-hücrelerini plakalardan ayırmaya başlamak için, üç mililitre hücre kopma reaktifi kullanarak.
Hücreleri 12 mililitre büyüme ortamıyla seyreltin ve 1, 400 kez G'de santrifüj le dört dakika toplayın. Büyüme ortamı10 mililitre hücre damak resuspend ve trypan mavi ve bir hücre sayacı ile hücrelerin konsantrasyonu ve canlılığını ölçmek. Plaka 700, 000 katlanarak büyüyen hücreler her bir kuyuya altı iyi kültür plakası içine ve 37 santigrat derece 24 saat boyunca kuluçka ve% 5 karbondioksit.
Ertesi gün, 200 mikrolitre transfeksiyon tamponuna iki mikrogram plazma DNA'sını seyreltin. Plazma DNA'sını 10 saniye boyunca girdap layın ve 4 dakika boyunca 1,400 kez G'de merkezi olarak koyun. Seyreltilmiş DNA'ya dört mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin.
10 saniye boyunca girdap ve santrifüj tekrarlayın. DNA'yı 23 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın, sonra transfeksiyon karışımını altı kuyu plakasındaki hek293 T hücrelerine ekleyin ve hücreleri 24 saat daha kuvöze geri verin. 10 milimolar stok konsantrasyonu için DMSO'da gazlı taşan levhalar, seyreltik inhibitör çözeltileri hazırlamak ve bunları hemen kullanım için 384 mm'lik bir düşük ölü hacimli kaynak plakaya dağıtmak için.
İstenilen inhibitörlerin veya aracın hacmini, sıvı bir işleyiciyi kullanarak 384 iyi gerçek zamanlı PCR plakasını %0,5 DMSO'dan daha az bir hedefte tespit edin. Plakaları, inert gaz temizleme ile bir plaka mühürleyici kullanarak mühür. Transfected hücreleri pre incubate büyüme ortamı hazırlamak ve 37 derece santigrat su banyosunda müfreze reaktifsatmak için.
Hücreleri kuvözden çıkarın ve medyayı kuyulardan nazikçe aspire edin. Her kuyuya hücre ayırma reaktifinin 0,3 mililitresini ekleyin ve plakayı iyice örtmek için plakayı ileri geri hafifçe sallayın. Plakayı 23 derecede iki dakika kuluçkaya yatırın.
Her kuyuya bir mililitre büyüme ortamı ekleyin ve kuyudaki hücreleri yavaşça pipetlendirin. Daha sonra hücreleri toplamak için dört dakika boyunca 1, 400 kez G'de 15 mililitrelik Falcon santrifüj tüpüsantrisine aktarın. Yavaşça medya aspire, sonra büyüme medya iki mililitre hücre pelet yeniden askıya.
Hücre canlılığının try pan blue ve hücre sayacı kullanarak %90'dan fazla olduğundan emin olun. Hücreleri mikrolitre başına 125 hücre konsantrasyonuna seyreltin, optimum canlılık için hücreleri en fazla iki saat süreyle süspansiyonda tutarak. SHP2 inhibitörleri ile kuluçka için, steril tek kanallı çözelti yalak içine hücreleri dağıtmak.
Santrifüj önceden hazırlanmış 384 iyi gerçek zamanlı PCR plaka 2, 500 kez G beş dakika, sonra mühür kaldırmak ve 125 mikrolitre çok kanallı pipet kullanmak, istenilen Wells seyreltilmiş hücrelerin beş mikrolitre eklemek için. Bir kapak olmadan 30 saniye boyunca 42 kez G plaka santrifüj, sonra bir kapak takın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir saat için plaka kuluçka. Termo cycler'ı termal profil gradyanı veya izotermal deney için el yazması talimatlara göre programla.
Termocycler ısı darbesi programını başlatın ve isliç blok üzerine hesap plakasını yerleştirin. Program bittiğinde, asay plakasını çıkarın. Lisanslı algılama ana karışımı beş mikrolitre ile tam olarak her bir sayis plakası.
Plakayı 42 kez G'de 30 saniye santrifüj edin ve 23 santigrat derecede karanlıkta 30 ila 60 dakika saklayın. Optimize edilmiş entegrasyon süresiile bir mikroplaka okuyucu kullanarak kemilüminesans ölçün. Yabani tip SHP2 için termal gradyan deney, katlanmış bir protein için tipik dar bir erime geçiş ile sigmoidal hücresel termal profil sonuçlandı.
Allosteric inhibitörü SHP099 ile yabani tip SHP2 inkübasyonu, önemli ve ölçülebilir derecede termal profil stabilize. SHP2 stabilizasyonu, aynı zamanda allosteric bileşikler gibi SHP099 gücü ile izlendi. 10 mikromolar at, daha güçlü RMC-4550, yabani tip SHP2 için SHP099 daha stabilizasyon daha büyük bir dereceye kadar üretti.
Benzersiz mekanizması sayesinde, Allosteric inhibitörleri gibi SHP099 SHP2-E76K dahil olmak üzere birçok SHP2 onkojenik mutantlara karşı daha az etkilidir. Bu bilinen özellikleri ile tutarlı shp2-E76K SHP099 tarafından sadece marjinal termal stabilizasyon görülmektedir. EPL etiket proteininin ifade düzeyi sinyal yoğunluğunu önemli ölçüde etkileyebilir.
Geçici ve stably entegre yabani tip hücreler için Termal profiller. aynı varlık koşulları altında gösterilir. Birbirinden farklı eğrilerin normalleştirilmesi, efc algılama sisteminin geniş yelpazesini ortaya çıkaran karşılaştırılabilir termal profiller sağlar.
384 kuyu plakasının kısa ekseninde termal degradeler üretmek için termal döngü yeteneğinden yararlanarak. bir dizi izotermal titrasyon tek bir plaka üzerinde yapılabilir. En uygun sıcaklıkta, tam 10 nokta doz-yanıt kullanarak bir isotermal titrasyon, RMC-4550 için yararlı bir EC50 verdi.
Bu varlığın ilkeleri PROTAC bileşikleri tarafından indüklenen hücrelerdeki proteinlerin bozulmasını izlemek için kullanılabilir. Biz mutant SHP2 ve lösemi inhibitörlerini keşfetmek için hücresel Thelma shift tekniği kullanıyoruz, sık SHP2 onkojenik mutantlara karşı özel ilaçlar bu kanserlerin tedavisinde önemli bir etkiye sahip olacaktır.
