La tirosina fosfatasa SHP2, es un mediador clave de la señalización celular, promover la supervivencia celular y la proliferación. Mi equipo se centra en la búsqueda de inhibidores SHP2 de moléculas pequeñas para el tratamiento del cáncer. Nuestra técnica proporciona un método rápido y potente para establecer penetrantes celulares, así como el compromiso objetivo de inhibidores SHP2 de molécula pequeña, en las células.
Esto garantiza que los recursos de detección se dirigen de manera eficiente. SHP2 como un objetivo atractivo para la terapia contra el cáncer. Y varios inhibidores de SHP2.están en ensayos clínicos.
Nuestra técnica para facilitar el descubrimiento de inhibidores de próxima generación con perfiles de eficacia mejorados. Demostrando el procedimiento estaría Celeste Romero, asistente de investigación y Douglas Sheffler, profesor asistente de investigación, de nuestro laboratorio. Para comenzar a separar las células T HEK293 de las placas, utilizando tres mililitros de reactivo de desprendimiento celular.
Diluir las células con 12 mililitros de medios de crecimiento, y recogerlas por centrifugación a 1.400 veces G, durante cuatro minutos. Resuspender el paladar celular en 10 mililitros de medios de crecimiento y medir la concentración y viabilidad de las células con azul tripano y un contador celular. Placa 700.000 células de crecimiento exponencial en cada pozo de una placa de cultivo de seis pozos e incubarlas durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Al día siguiente, diluir dos microgramos de ADN plasmático en 200 microlitros de tampón de transfección. Vórtice el ADN plasmático durante 10 segundos y centralízalo a 1.400 veces G durante cuatro minutos. Añadir cuatro microlitros de reactivo de transfección al ADN diluido.
Vórtice durante 10 segundos, y repita la centrifugación. Incubar el ADN a 23 grados celsius durante 10 minutos, luego añadir la mezcla de transfección a las células T HEK293 unidas en la placa de seis pozos, y devolver las células a la incubadora durante otras 24 horas. Para preparar placas de ensayo, diluir las soluciones inhibidoras en DMSO, para una concentración de stock de 10 mililitros y dispensarlas en una placa de origen de 384 pozos de bajo volumen muerto, para su uso inmediato.
Detecte el volumen deseado de inhibidores o vehículo, utilizando un manipulador de líquidos en placas PCR en tiempo real de 384 pozos a un volumen final objetivo inferior al 0,5% DMSO. Selle las placas con un sellador de placas con purga de gas inerte. Para preparar las células trans infectadas preincisan medios de crecimiento y vendan reactivos de desprendimiento en un baño de agua de 37 grados centígrados.
Retire las células de la incubadora y aspire suavemente los medios de los pozos. Agregue 0,3 mililitros del reactivo de desprendimiento de la célula a cada pozo, y balancee suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para cubrir a fondo la superficie de la placa inferior. Incubar la placa a 23 grados centígrados durante dos minutos.
Añadir un mililitro de medios de crecimiento a cada pozo, y pipetear suavemente las células en el pozo. Luego transfiérelos a un tubo centrífugo Falcon de 15 mililitros Centrifugar las células a 1.400 veces G durante cuatro minutos para recoger las células. Aspirar suavemente los medios, luego resuspender el pellet celular en dos mililitros de medios de crecimiento.
Asegúrese de que la viabilidad de la celda sea superior al 90% utilizando el campo de prueba azul y un contador de celdas. Diluir las células a una concentración de 125 células por microlitro, manteniendo las células en suspensión durante no más de dos horas para una viabilidad óptima. Para la incubación con inhibidores SHP2, dispensar las células en una solución estéril de un solo canal.
Centrifugar la placa PCR en tiempo real de 384 bien preparada previamente a 2.500 veces G durante cinco minutos, luego retire el sello y utilice una pipeta multicanal de 125 microlitros, para agregar cinco microlitros de las células diluidas a los Wells deseados. Centrifugar la placa a 42 veces G durante 30 segundos sin tapa, luego coloque una tapa e incubar la placa durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Programe el ciclor Thermo, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito para el gradiente de perfil térmico o el experimento isotérmico.
Inicie el programa de pulsos de calor termocicloct y coloque la placa de ensayo en el bloque térmico. Cuando finalice el programa, retire la placa de ensayo. Complemente cada pozo de la placa de ensayo con cinco microlitros de mezcla maestra de detección con licencia.
Centrifugar la placa a 42 veces G durante 30 segundos, y guárdela a 23 grados Centígrados en la oscuridad durante 30 a 60 minutos. Mida la quimiuminescencia utilizando un lector de microplacas con el tiempo de integración optimizado. El experimento de gradiente térmico para el tipo salvaje SHP2, resultó en un perfil térmico celular sigmoidal con una transición de fusión estrecha que es típica de una proteína plegada.
Incubación de tipo salvaje SHP2 con el inhibidor alostérico SHP099, estabilizado al perfil térmico en un grado significativo y medible. La estabilización de SHP2, también rastreada con la potencia de SHP099 como compuestos alostéricos. Con 10 micromolares, el RMC-4550 más potente, produjo un mayor grado de estabilización que SHP099 para el tipo salvaje SHP2.
Debido a su mecanismo único, SHP099 como inhibidores alostéricos son menos eficaces contra muchos mutantes oncogénicos SHP2, incluyendo SHP2-E76K. De acuerdo con estas propiedades conocidas sólo se observa la estabilización térmica marginal de SHP2-E76K por SHP099. El nivel de expresión de la proteína de etiqueta EPL puede influir dramáticamente en la intensidad de la señal.
Perfiles térmicos para células silvestres transitorias e integradas de forma estable. en condiciones de activos idénticas. La normalización de las curvas dispares ofrece perfiles térmicos comparables, revelando la amplia gama del sistema de detección EFC.
Aprovechando la capacidad del ciclor térmico para producir gradientes térmicos en el eje corto de una placa de 384 pozos. una serie de valoraciones isotérmicas se pueden realizar en una sola placa. A una temperatura óptima, una valoración isotérmica utilizando una dosis-respuesta completa de 10 puntos, produjo un EC50 útil, para RMC-4550.
Los principios de este activo podrían utilizarse para controlar la degradación de las proteínas en las células, inducidas por compuestos PROTAC. Estamos utilizando la técnica de cambio celular Thelma para descubrir inhibidores de mutantes SHP2 y leucemias, fármacos específicos contra mutantes oncogénicos SHP2 frecuentes tendrán un impacto significativo para el tratamiento de estos cánceres.
