Тирозин фоспатазы SHP2, является ключевым посредником клеточной сигнализации, содействие выживанию клеток и распространения. Моя команда сосредоточена на поиске малых молекул SHP2 ингибиторы для лечения рака. Наша техника обеспечивает быстрый и мощный метод установления клеток-пенетрантов, а также целевого взаимодействия малых молекул SHP2 ингибиторы, в клетках.
Это гарантирует, что ресурсы обнаружения эффективно направлены. SHP2 как привлекательная цель для лечения рака. И несколько ингибиторов SHP2, находятся в клинических испытаниях.
Наша методика для облегчения открытия ингибиторов следующего поколения с улучшенными профилями эффективности. Демонстрация процедуры будет Селеста Ромеро, научный сотрудник и Дуглас Леффлер, доцент-исследователь, из нашей лаборатории. Для начала отсоедините HEK293 Т-клетки от пластин, используя три миллилитров реагента клеточного отслоения.
Разбавить клетки 12 миллилитров средств роста, и собирать их центрифугации в 1400 раз G, в течение четырех минут. Resuspend неба клетки в 10 миллилитров средств роста и измерения концентрации и жизнеспособности клеток с трипан синий и счетчик клеток. Плита 700 000 экспоненциально растущих клеток в каждый колодец из шести пластин культуры хорошо и инкубировать их в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию, и 5%углекислого газа.
На следующий день разбавьте два микрограмма плазменной ДНК в 200 микролитров трансфектного буфера. Вихрь ДНК плазмы в течение 10 секунд и centralfuge его на 1400 раз G в течение четырех минут. Добавьте четыре микролитров трансфектного реагента в разбавленную ДНК.
Вихрь его в течение 10 секунд, и повторить центрифугации. Инкубировать ДНК при 23 градусах по Цельсию в течение 10 минут, затем добавить смесь трансфекции в прилагаемые HEK293 Т-клеток в шесть пластин хорошо, и вернуть клетки в инкубатор еще на 24 часа. Для подготовки анализных пластин, разбавить ингибиторные растворы в DMSO, для концентрации запасов 10 миллимолярд и обойтись их в 384 хорошо низкой мертвой пластины источника объема, для немедленного использования.
Обнаружить желаемый объем ингибиторов или транспортного средства, используя жидкий обработчик в 384 хорошо в режиме реального времени ПЦР пластин при целевом окончательном объеме менее 0,5% DMSO. Печать пластин с помощью уплотнения пластины с инертной очистки газа. Для подготовки трансфицированных клеток предварительно инкубировать рост средств массовой информации и продавать реагент отряда в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
Удалите клетки из инкубатора и аккуратно аспирировать средства массовой информации из колодцев. Добавьте 0,3 миллилитров реагента клеточного отслоения к каждому хорошо, и аккуратно раскачивайте пластину вперед и назад, чтобы тщательно покрыть поверхность дна пластины. Инкубировать пластину при 23 градусах по Цельсию в течение двух минут.
Добавить один миллилитр средств роста к каждой хорошо, и осторожно пипетки клетки в колодец. Затем перенесите их в 15 миллилитровую центрифугу Falcon трубки Центрифуга клетки на 1, 400 раз G в течение четырех минут, чтобы собрать клетки. Аккуратно аспирировать средства массовой информации, а затем повторно поместить гранулы клетки в двух миллилитров средств массовой информации роста.
Убедитесь, что жизнеспособность ячейки превышает 90%, используя try pan blue и счетчик ячеек. Разбавить клетки до концентрации 125 клеток на микролитер, сохраняя клетки в суспензии в течение не более двух часов для оптимальной жизнеспособности. Для инкубации с ингибиторами SHP2, обойтись клетки в стерильных одного канала раствор корыта.
Центрифуга ранее подготовленных 384 хорошо в режиме реального времени ПЦР пластины на 2500 раз G в течение пяти минут, а затем удалить печать и использовать 125 микролитр многоканальные пипетки, чтобы добавить пять микролитров разбавленных клеток в желаемых скважин. Центрифуга пластины в 42 раза G в течение 30 секунд без крышки, затем прикрепить крышку и инкубировать пластину в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Запрограммируйте циклир Thermo, в соответствии с рукописными указаниями либо для градиента теплового профиля, либо для изотермального эксперимента.
Запустите программу термоциклера теплового импульса и поместите анализную пластину на тепловой блок. Когда программа будет закончена, удалите анализную пластину. Дополнить каждый колодец анализной пластины пятью микролитров лицензированного обнаружения мастер смеси.
Центрифуга пластины в 42 раза G в течение 30 секунд, и хранить его при 23 градусов по Цельсию в темноте в течение 30 до 60 минут. Измерьте хемилюминесценцию с помощью микропластинной считыватель с оптимизированным временем интеграции. Эксперимент по тепловому градиенту для дикого типа SHP2 привел к сигмоидно-клеточному тепловому профилю с узким плавильным переходом, характерным для сложенного белка.
Инкубация дикого типа SHP2 с алостерическим ингибитором SHP099, стабилизировалась до теплового профиля в значительной и измеримой степени. Стабилизация SHP2, также отслеживается с потенцией SHP099, как алостерические соединения. На 10 микромолях, более мощный RMC-4550, производится большая степень стабилизации, чем SHP099 для дикого типа SHP2.
Благодаря своему уникальному механизму, SHP099, как алостерические ингибиторы являются менее эффективными против многих онкогенных мутантов SHP2, в том числе SHP2-E76K. В соответствии с этими известными свойствами наблюдается лишь предельная тепловая стабилизация SHP2-E76K SHP099. Уровень экспрессии белка тега EPL может значительно повлиять на интенсивность сигнала.
Тепловые профили для переходных и стабилически интегрированных клеток дикого типа. при одинаковых условиях активов отображаются. Нормализация разрозненных кривых обеспечивает сопоставимые тепловые профили, раскрывая широкий спектр системы обнаружения ЕФК.
Воспользовавшись способностью теплового цикла производить тепловые градиенты на короткой оси пластины 384 хорошо. серия изотермальных титраций может быть выполнена на одной тарелке. При оптимальной температуре изотермальная титра с использованием полной 10-тоной дозы-ответа дала полезный EC50 для RMC-4550.
Принципы этого актива могут быть использованы для мониторинга деградации белков в клетках, индуцированных соединениями PROTAC. Мы используем клеточной Тельма сдвиг техники для обнаружения ингибиторов мутантов SHP2 и лейкемии, препараты, специфические против частых онкогенных мутантов SHP2 будет иметь значительное влияние для лечения этих видов рака.
