La tyrosine phosphatase SHP2, est un médiateur clé de la signalisation cellulaire, la promotion de la survie cellulaire et la prolifération. Mon équipe se concentre sur la recherche de petites molécules inhibiteurs du SHP2 pour le traitement du cancer. Notre technique fournit une méthode rapide et puissante pour établir des pénétrirants cellulaires, ainsi que l’engagement cible de petites molécules inhibiteurs du SHP2, dans les cellules.
Ceci est assuré, les ressources de découverte sont dirigées efficacement. SHP2 comme une cible attrayante pour la thérapie contre le cancer. Et plusieurs inhibiteurs du SHP2.sont en essais cliniques.
Notre technique pour faciliter la découverte d’inhibiteurs de prochaine génération avec des profils d’efficacité améliorés. Celeste Romero, assistante de recherche, et Douglas Sheffler, professeur adjoint de recherche, de notre laboratoire, feraient une démonstration à la procédure. Pour commencer à détacher hek293 T-cellules des plaques, en utilisant trois millilitres de réaccélément de détachement cellulaire.
Diluer les cellules avec 12 millilitres de supports de croissance, et les recueillir par centrifugation à 1400 fois G, pendant quatre minutes. Resuspendez le palais cellulaire en 10 millilitres de supports de croissance et mesurez la concentration et la viabilité des cellules avec du bleu trypan et un compteur cellulaire. Plaque 700 000 cellules de croissance exponentielle dans chaque puits d’une plaque de culture de six puits et les incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, et 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain, diluer deux microgrammes d’ADN plasmatique en 200 microlitres de tampon transfection. Vortex l’ADN plasmatique pendant 10 secondes et le centraliser à 1400 fois G pendant quatre minutes. Ajouter quatre microlitres de réaccente de transfection à l’ADN dilué.
Vortex pendant 10 secondes, et répéter la centrifugation. Incuber l’ADN à 23 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis ajouter le mélange de transfection aux cellules T HEK293 attachées dans la plaque de six puits, et retourner les cellules à l’incubateur pendant encore 24 heures. Pour préparer des plaques d’analyse, diluer les solutions d’inhibiteur dans DMSO, pour une concentration de stock de 10 millimolaires et les distribuer dans une plaque source de 384 puits à faible volume mort, pour une utilisation immédiate.
Repérait le volume désiré d’inhibiteurs ou de véhicule, à l’aide d’un gestionnaire liquide dans 384 plaques PCR bien en temps réel à un volume final cible inférieur à 0,5 %DMSO. Sceller les plaques à l’aide d’un scellant à plaque avec purge au gaz inerte. Préparer les cellules transfectées précuber les supports de croissance et vendre le reagent de détachement dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius.
Retirer les cellules de l’incubateur et aspirer doucement le média des puits. Ajouter 0,3 millilitres de réaccente de détachement cellulaire à chaque puits et faire basculer doucement la plaque d’avant en arrière pour couvrir complètement la surface du fond de la plaque. Incuber la plaque à 23 degrés Celsius pendant deux minutes.
Ajouter un millilitre de supports de croissance à chaque puits, et pipette doucement les cellules dans le puits. Ensuite, transférez-les dans un tube de centrifugeuse Falcon de 15 millilitres Centrifugeuse les cellules à 1400 fois G pendant quatre minutes pour recueillir les cellules. Aspirez doucement le média, puis resuspendez la pastille cellulaire en deux millilitres de supports de croissance.
Assurez-vous que la viabilité de la cellule est supérieure à 90% en utilisant essayez pan bleu et un compteur cellulaire. Diluer les cellules à une concentration de 125 cellules par microlitre, en gardant les cellules en suspension pendant au plus deux heures pour une viabilité optimale. Pour l’incubation avec des inhibiteurs du SHP2, distribuez les cellules dans une auge stérile de solution à canal unique.
Centrifugeuse la plaque PCR bien préparée précédemment en temps réel à 2 500 fois G pendant cinq minutes, puis retirez le joint et utilisez une pipette multicanal de 125 microlitres, pour ajouter cinq microlitres des cellules diluées aux puits désirés. Centrifuger la plaque à 42 fois G pendant 30 secondes sans couvercle, puis fixer un couvercle et incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Programmez le cycleur Thermo, selon les instructions manuscrites pour le gradient de profil thermique ou l’expérience isothermale.
Démarrez le programme d’impulsion thermique thermocycler et placez la plaque d’essai sur le bloc thermique. Lorsque le programme est terminé, retirez la plaque d’analyse. Compléter chaque puits de la plaque d’essai avec cinq microlitres de mélange maître de détection sous licence.
Centrifugez la plaque à 42 fois G pendant 30 secondes, et stockez-la à 23 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 à 60 minutes. Mesurez la chimioluminescence à l’aide d’un lecteur de microplaque avec le temps d’intégration optimisé. L’expérience de gradient thermique pour le type sauvage SHP2, a abouti à un profil thermique cellulaire sigmoïdal avec une transition de fusion étroite qui est typique pour une protéine pliée.
Incubation de type sauvage SHP2 avec l’inhibiteur allosterique SHP099, stabilisée au profil thermique à un degré significatif et mesurable. La stabilisation de SHP2, également suivi avec la puissance de SHP099 comme les composés allotériques. À 10 micromolar, le RMC-4550 plus puissant, a produit un plus grand degré de stabilisation que SHP099 pour le type sauvage SHP2.
En raison de leur mécanisme unique, SHP099 comme les inhibiteurs allosteriques sont moins efficaces contre de nombreux mutants oncogènes SHP2, y compris SHP2-E76K. Conformément à ces propriétés connues, seule la stabilisation thermique marginale de SHP2-E76K par SHP099 est observée. Le niveau d’expression de la protéine d’étiquette EPL peut influencer considérablement l’intensité du signal.
Profils thermiques pour les cellules de type sauvage transitoires et durablement intégrées. dans des conditions d’actifs identiques sont indiquées. La normalisation des courbes disparates offre des profils thermiques comparables, révélant la large gamme du système de détection EFC.
Profitant de la capacité du cycleur thermique pour produire des gradients thermiques sur l’axe court d’une plaque de puits 384. une série de titrations isothermales peut être effectuée sur une seule plaque. À une température optimale, une titration isothermale utilisant une dose-réponse complète de 10 points, a donné un EC50 utile, pour RMC-4550.
Les principes de cet actif pourraient être utilisés pour surveiller la dégradation des protéines dans les cellules, induite par les composés PROTAC. Nous utilisons la technique cellulaire de décalage de Thelma pour découvrir des inhibiteurs du SHP2 mutant et des leucémies, les drogues spécifiques contre les mutants oncogènes fréquents de SHP2 auront un impact significatif pour le traitement de ces cancers.
