Bu çalışma NIH ve ACS, T32CA009135 dahil CA133027, CA070723 ve CA022443 hibe tarafından finanse edildi. Bill Sugden bir Amerikan Kanser Derneği Araştırma Profesörü.

1. Görünür Plazmidler ile Hücre Mühendisliği <ol><li> Görüntülenecek plazmid içine laktoz operatör dizisi (Laco) yaklaşık 250 kopya içeren bir DNA parçası tanıtmak için standart sınırlama sindirimi ya da homolog rekombinasyon teknikleri kullanın. Bizim plazmid yaklaşık 170 kbp bir BACmid ve Kaposi sarkomu-ilişkili Herpes Virus tüm genom (KSHV) ve higromisin 12 kodlanmış direnç içeriyordu. </li><li> Tanıtılması Laco içeren lipofektamin 2000 ile transfeksiyon yoluyla memeli hücrelerine plazma DNA. Biz, 25ul lipofektamin 2000, 0.5 ml OptiMEM ve 3.5 ml DMEM ile saflaştırılmış plazmid DNA 10 ug ile 4 saat için 60 mm tabaklar içinde HeLa ve SLK hücreleri transfekte. </li><li> 48 saat süreyle% 10 fetal bovin serumu ve inkübe hücreleri ile 5 ml DMEM için kültür ortamı değiştirin. </li><li> Tanıtılan pla için bir antibiyotik seçimi içeren medyumda büyük bulaşık ve kültür hücreleri içinde düşük yoğunluklu Levha hücrelerinSmid; anda 300 ug / 3 hafta için mL higromisin ile% 10 fetal bovin serumu ile DMEM içinde hücreler seçilir. </li><li> Yeni kültür kaplarına higromisin dayanıklı koloniler aktarmak için steril, tripsin bulanmış filtre kağıt parçaları kullanın. </li><li> Transfekte klonlar çanak doldurmak için büyüdü zaman, sınırlama sindirim için DNA izole ve Güney plazmid Laço bir polimer homojen ve beklenen boyutu sağlamak için blotting. </li><li> Plazmid Laci bir füzyon ifade tasarlandı değilse, örneğin Laci-tdTomato olarak kırmızı floresan proteini, erimiş laktoz repressör (Laci) kodlayan bir retrovirüs ile uygun klonlar bulaştırabilir. Biz tdTomato ziyade uzun süre 13 üzerinden birden fazla maruziyet oluşacak photoxicity aza indirmek için yeşil yakın floresan proteinleri kullanır. </li><li> Bir kez Laci füzyon proteininin kültür bağlayıcı ikinci füzyon proteinleri engellemek için 200 ug / ml izopropil-BD-thiogalactoside (IPTG) varlığında, hücre tanıtılmaktadırDNA. </li><li> Kültür en az 3 gün için hücreler LACI tdTomato-protein ifadesini sağlamak için. </li><li> Ilişkisiz füzyon proteini az arka plan düzeyleri ile farklı sinyaller ortaya Laci-tdTomato optimal düzeyde olanlar için Ekran klonlar (IPTG yıkayarak ve aşağıda açıklandığı gibi hücreleri inceleyen). </li></ol> 2. Görüntüleme Sistemi Geliştirilmesi Bizim görüntüleme sistemi motorlu bir sahne ve Plan-Aochromat 63x/1.4 yağlı objektif ile donatılmış bir Zeiss Axiovert 200M oluşur. Floresans uyarma ışık Colibri sistemi LED &quot;nötr beyaz&quot; tarafından sağlanmaktadır. Emisyon bir CascadeII tarafından algılanır: 1024 EMCCD kamera. Bu yükseltici sinyalleri için bir kazanç kayıt ile soğutmalı, arkadan-inceltilmiş kamera; karanlık akımı saniyede piksel başına 0.061 elektronlar ve kuantum verimliliği 0.90 daha fazladır. Sistem SmartExperiments modül de dahil olmak üzere, Axiovision 4.8 yazılımı ile kontrol edilmektedir. TdToma tespiti içinBiz bunun için geçen ışığın% 85 flor ve yayılan ışığın% 95 heyecanlandırmak bir Zeiss filtre seti 75HE kullanmak için emisyon filtresi geçecek. <ol><li> Birden uzun zaman aralıkları boyunca görüntülerin otomatik alımlar için hassas sinyallerin tespiti, spesifik uyarım ve hızlı perde, motorlu sahne ve odak kol için bir LED ışık kaynağı ve yazılım kontrolü için bir inverted mikroskop ve bir EMCCD kamera ile görüntüleme sistemi monte z-yığınları. Sistem titreşim izole edilecek bir hava masaya oturmak gerekir. </li><li> 37 ° C, nemlendirilmiş bir oda içinde% 5-10 CO 2 hücrelere korumak için bir safha-üst kuluçka makinesi birleştirin. Deney sırasında hareket artefaktları en aza indirmek için bir sabit sıcaklıkta gelmek sistemi için yeterli zaman tanıyın. </li><li> Örnek ısı sifon ve objektif önlemek için hedef için bir ısıtılmış yaka. </li></ol> 3. İşaretlenmiş DNA görselleştirilmesi <ol><li> 35 mm Levha hücrelerhücre çiftlerinin örtüşen olmadan 8-16 hücre kolonileri haline bölmek için izin verecek az% 10 birleştiği bir yoğunlukta cam alt tabak. Canlı hücreleri bölmek için zaman var, böylece görüntüleme önce bu en az 24-48 saat yapın. </li><li> Görüntüleme başlamadan önce bir ila üç saat, seçici ilaçlar ve IPTG hem yoksun besiyeri ile plaka 3 kere yıkayın. Bu prosedür, uzak olmayan canlı hücre yıkar ve Software füzyon proteinleri plazmid içinde Laco siteleri bağlanmasına izin verir. </li><li> % 10 fetal bovin serumu ve 25 mM HEPES ile 2 ml DMEM kültür ortamı ile değiştirin. </li><li> CultFoil ile kültür çanak üst değiştirin, bir 35 mm çanak için bir montaj halka uzanıyordu. Bu kapak saat boyunca tuz konsantrasyonunu arttırmak ve hücreleri öldürür kültür ortamı, bir buharlaşma inhibe edecektir. </li><li> Hücreleri görüntüleyebilir ve birden çok alanda üst ve hücrelerin alt odak düzlemi belirlemek için diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme kullanın.Her alanda, her hücrenin üst bir odak düzlemi yolu yaklaşık 1/3 aşağı hareket ettirin. , Y, x katılım, z kaydedilmiş aşama pozisyonların liste halinde düzenler. Not: Plazmid sinyalleri hücreler Laci füzyon proteini için uygun dalga boyunda LED&#39;ler tarafından aydınlatılır Gözmerceklerinden görünür olmayabilir. Zayıf sinyallerinin zaman içinde sinyalin entegrasyonuna izin verir ve bu nedenle etkili zayıf sinyalleri yükseltir EMCCD kamera kullanımı ile görülebilir. </li><li> Mikroskop kontrol yazılımı olarak, kaydedilen her aşamada pozisyonda yapılacak görüntülerin bir z-yığın tanımlar. Z boyutu 14 yaklaşık Nyquist örnekleme size izin verir 0,35-0,50 mikron az adım boyutu seçin. Hücrelerin yer aldığı yukarıda ve aşağıda düzlemleri &quot;fazladan&quot; dilim dahil edilmesi; bu dilimleri hücre döngüsü sırasında hücre hareketlerini takip tespitine izin verir ve aynı zamanda resim yığınlarının alım sonrası işlem (Dekonvolüsyon) olarak kullanılır. Bu dahil olacakhücrelerin kalınlığına bağlı olarak, 40-60 görüntüleri bir yığın ile sonuçlanır. </li><li> Mikroskop kontrol yazılımı olarak, (plazmidler görselleştirmek için 10-60 dk aralıklarla 30 dakika aralıklarla (uzun süreler boyunca hücre bölünmeleri ve göçler izlemek için) ve floresans görüntüleri z yığınlarının bir aydınlık alana görüntü toplamak için bir zaman serisi deneme tanımlamak hücre içinde). Uzun deneyler boyunca fototoksisite için gereksiz hücrelerin açığa çıkarabilir standart parlak bir alan görüntüleme, daha fazla ışık gerektirir, deneme sırasında DIC görüntüleme kullanmayın. </li><li> Yazılım kontrollü deney başlatın. Sistemi deneme sırasında (aşırı oda ışığı, vb maruz çarptı) rahatsız değil emin olun. </li><li> Eğer gerekirse, deney sırasında nemlendirme sistemi içinde su doldurmak. </li></ol> 4. Görüntüler Post-satın İşleme <ol><li> Her z-yığını ve zaman noktası için görüntüleri inceleyin. Gereksiz alanları dışında kırpmaBir sonraki adımda bilgisayar işlem süresini azaltmak için görüntüler. </li><li> Her z-yığını 15 menşe piksele sinyal yoğunluğu yeniden atamak için bir ters evrişim algoritması kullanın. Bu ters evrişim görüntüleme sistemi için teorik bir nokta dağılım fonksiyonu dayalı olabilir iken, görüntüleme floresan mikrosferler tarafından belirli bir sistemi nokta dağılım fonksiyonu ölçmek ve ters evrişim algoritması bu ölçüm kullanılması tercih edilir. Biz görüntüleme sisteminin nokta dağılım fonksiyonu ölçülür ve uygulanan bir AxioVision yazılım (AxioVision yazılım tanımı, Zeiss) maksimum olabilirlik algoritması iteratif kısıtlı. </li><li> Intensite değişiklikleri ve hareketleri plazmid hücre döngüsü sırasında ve yavru hücrelere plazmid bölümleme izlemek için görüntüleri inceleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li><li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi's+sarcoma.">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li><li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology 2 volume set. , (2006).</li><li>Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+latent+Epstein-Barr+virus+genomes+in+Raji+cells.">Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells.</a> J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).</li><li>Humme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EBV+nuclear+antigen+1+(EBNA1)+enhances+B+cell+immortalization+several+thousandfold.">The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).</li><li>Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimal+replicator+element+of+the+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+terminal+repeat+supports+replication+in+a+semiconservative+and+cell-cycle-dependent+manner.">The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner.</a> J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).</li><li>Yates, J. L., Guan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus-derived+plasmids+replicate+only+once+per+cell+cycle+and+are+not+amplified+after+entry+into+cells.">Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells.</a> J. Virol. 65, 483-488 (1991).</li><li>Ye, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence.">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li><li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+synthesis+and+partitioning+of+EBV's+plasmid+replicon+is+revealed+in+live+cells.">The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells.</a> Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).</li><li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+Kaposi's+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals.">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li><li>Zhou, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome:+application+for+genetic+analysis.">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+pixels,+and+gray+levels:+digitizing+image+data.">Points, pixels, and gray levels: digitizing image data.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+enhancement+by+deconvolution.">Image enhancement by deconvolution.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada açıklanan yöntem birden fazla nesil boyunca süren süre boyunca canlı memeli hücrelerinin plasmidlerin takip etmek için kullanılabilir. Uyarma ışığa maruz sınırlayarak, biz en az 72 saat ve 3 hücre bölünmeleri temsil, 16-32 hücre kolonileri yoluyla yeni bölünmüş çiftlerinden hücreler takip etmek bu teknikler kullandık. Bu deneyler gibi kantitatif PCR, blot Güney ve FISH gibi statik analizler sonucu elde edilen edilemez bilgi sağlar. Bu tür tandem Laço tekr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomisin sülfat </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Higromisin </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> SLK 400 ug / ml; 300 mikrogram / HeLa için ml </td></tr><tr><td> İzopropil-BD-thiogalactoside (IPTG) </td><td> Roche </td><td> 10 724 815 001 </td><td> Nihai konsantrasyonu 200 ug / ml </td></tr><tr&gt; <td> Lipofektamin 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Cam alt yemekler </td><td> Mattek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> Nötr beyaz LED </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre Küp 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Plan-Apochromat 63x/1.4 hedefi </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII: 1024 EMCCD kamera </td><td> Fotometrik </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol minivan </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37-2 dijital </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTI Kontrolör 3700 dijital </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> Amaç ısıtıcı </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Sahne ısıtma elemanı P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> Sahne üstü İnkübatör S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> Nemlendirici Sistemi </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring plasmid replication in live mammalian cells over multiple generations by fluorescence microscopy

Birkaç doğal olarak meydana gelen plazmid, memeli hücrelerinde muhafaza edilir. Bunlar arasında çok sayıda insan maligniteleri 1-3 neden Epstein-Barr virüsü (EBV) ve Kaposi sarkomu-ilişkili herpes (KSHV) dahil gama-herpesvirüslerinkiler genomlar vardır. Bu iki genom onların eksik geleneksel sentromer 4-8 rağmen lisanslı bir şekilde, tek bir viral protein ve hücresel replikasyon makine kullanarak her çoğaltılır ve hücre bölünmesi sırasında yavru hücrelere iletilir. Çok iş gibi Southern blot ve in situ hibridizasyon (FISH) floresans gibi yöntemler kullanarak bu plazmid genomların tekrarlamalı karakterize etmek için yapılmıştır. Bu yöntemler, yine de sınırlıdır. Kantitatif PCR ve Southern blot hücrelerinin bir nüfus hücre başına plazmid ortalama sayısı hakkında bilgi verir. BALIK ortalama sayı ve plazmid dağılım hem de ortaya çıkaran bir tek hücreli bir testtir<html> ancak hücre popülasyonunda s hücre başına incelendiğinde hücrenin ebeveyni veya soyu hakkında hiçbir bilgi sağlayan, statik. Burada, canlı hücrelere plazmid görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, ilgi 9 plazmid içinde çoklu sitelere karşı bir fluoresan etiketli laktoz repressör protein bağlayıcı esas alınmaktadır. Ilgi DNA laktoz operatörü (Laço) dizisinin yaklaşık 250 tandem tekrarlar dahil tasarlanmıştır. Laco özellikle bir floresan protein oluşturacak şekilde eklenebilir laktoz repressör proteini (Software) ile bağlıdır. Füzyon proteini ya da işlenmiş plazmid veya bir retroviral vektör tarafından piyasaya eksprese edilebilir. Bu şekilde, DNA molekülleri floresan etiketlendi ve bu nedenle floresan mikroskobu yolu ile görünür hale gelir. Plazmitler görüntülenmesi için hazır olana kadar füzyon proteini IPTG varlığında hücreleri kültür tarafından plazmid DNA bağlanmasını bloke edilir. ontent &quot;&gt; Bu sistem, plazmidler, birçok nesil boyunca canlı hücreler sentezi özelliklerini açığa ve yavru hücrelere bölünmesi olarak takip edilmesine olanak sağlamaktadır. ideal hücreler yapışık olan, kolaylıkla transfekte edilen ve büyük çekirdekler sahiptir. Bu teknik belirlemek için kullanılmıştır ki EBV-türetilmiş plazmidler,% 84 her bir üretim sentezlenmiş ve yeni sentez edilmiş plazmid bölme% 88 sadakatle HeLa hücreleri içinde yavru hücrelere. EBV, bu plasmidlerin çiftleri olarak sentez sonra için gergin veya kardeş kromatid ile ilişkili olduğu görüldü S- Onlar Anafaz 10 ayrılan kardeş kromatidler olarak ayırmak görüldü kadar faz. yöntem şu anda HeLa hücreleri ve SLK hücrelerinde KSHV genomlarının replikasyonu incelemek için kullanılmaktadır. HeLa hücreler insan epitel hücreleri ölümsüzleştirdi vardır, ve SLK hücreleri ölümsüzleştirdi endotel insan hücreler. SLK hücreler başlangıçta KSHV lezyon türetilmiş olmasına rağmen, HeLa ne SLK hücre hattı ne doğal harbors KSHV genomu 11. Viral replikasyon okuyan ek olarak, bu görüntüleme tekniği ayrıca, kaldırma ya da sentez, lokalizasyon, ve diğer rekombinant plazmit DNA bölünmesi ile ilgili çeşitli DNA sekansı elemanların mutasyon etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

<html> Temsili bir deney içinde elde edilen z-yığınlarının azami yoğunluk projeksiyonlar Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Tipik plazmid sinyalleri, tek ya da plazmid kümeleri temsil bağlı olarak z-yığının 3-8 dilim içinde mevcut bulunmaktadır. Hücre mitoz ulaşana kadar EBV ve KSHV türetilmiş plazmidler durumunda, sinyalleri hücre içinde yavaşça hareket eder. Hücrelerin kendileri deney boyunca geçirilir. Onlar da küresel hale ve mitoz sırasında çanak terketmez. Sağlıklı ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Canlı hücreler içinde ayrı DNA molekülleri gözlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu teknik ilgi DNA içine yerleştirilmiştir bağlanma yerleri için bir floresan etiketlendi lac represör proteininin bağlayıcı esas alınmaktadır. Bu yöntem, zaman içindeki çok sayıda canlı hücreler rekombinant DNA izlemek için adapte edilebilir.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

monitoring-plasmid-replication-live-mammalian-cells-over-multiple

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Görüntüleme.  University of Wisconsin - Madison. Canlı hücreler içinde ayrı DNA molekülleri gözlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu teknik ilgi DNA içine yerleştirilmiştir bağlanma yerleri için bir floresan etiketlendi lac represör proteininin bağlayıcı esas alınmaktadır. Bu yöntem, zaman içindeki çok sayıda canlı hücreler rekombinant DNA izlemek için adapte edilebilir.

Video: Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Biyoloji

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...