Plazma lipoproteinlerinin analizi hiperlipidemi tanısı ve aterosklerozun araştırılması için çok önemlidir. Bu protokolde, plazma lipoproteinlerini izole etmek için ultrasantrifüjasyon kullanarak temel yöntemi tanıtacağız. Bu yöntem, araştırmacıların yedi lipoprotein fraksiyonunu izole etmek için bir mililitre plazma kullanmalarını sağlar.
Bu fraksiyonlar lipitler, apolipoproteinler ve iyi fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir Bu yöntem dislipidemi ve ilgili hastalığın tanısı için hem insan hem de hayvan örnekleri için uygulanabilir. Her polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne bir mililitre plazma aktararak başlayın. Daha sonra tüpleri sabit açılı bir rotora yükleyin ve plazmayı dört santigrat derecede 2,5 saat boyunca 356.000 kez G'de santrifüj edin.
Bıçağın tüp dilimleyicideki konumunu üst fraksiyon ile alt fraksiyon arasındaki bir seviyeye ayarlayın. Tüpleri bir dilimleyici kullanarak kesin ve üst fraksiyonu, yaklaşık 200 mikrolitreyi yeni bir mikro tüpe toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın.
Aynı yoğunluk çözümünü ekleyerek toplam hacmi 800 mikrolitreye ayarlayın. Mililitre çözelti başına 1,21 gramlık 58,9 mikrolitre ve toplam bir mililitre hacim için mililitre çözeltisi başına 1,02 gramlık 141,1 mikrolitre ekleyerek alt fraksiyonu mililitre başına 1,02 gram yoğunluğa ayarlayın. Bu tüpleri sabit açılı rotora ve santrifüje 356, 000 kez G'de dört santigrat derecede 2,5 saat boyunca yükleyin.
Mililitre başına 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 ve 1,21 gram kesir yoğunlukları için üst kesirleri toplamaya, alt kesirlerin yoğunluğunu ayarlamaya ve santrifüjlemeye devam edin. Son ultrasantrifüj için, 513,000 kez G'de santrifüj dört santigrat derecede dört saat boyunca. Normal standart bir diyet veya yüksek kolesterol diyeti ile beslenen tavşanların lipoprotein profilleri burada gösterilmiştir.
Tavşanlar otçuldur, bu nedenle plazma TC, TG ve PL seviyeleri genellikle insanların ve farelerinkinden daha düşüktür. Normal standart diyetle beslenen tavşanlarda, TC esas olarak HDL3 ve LDL olarak dağıtılır. Normal standart diyette vahşi tip tavşanlarda plazma TG'nin %39'u VLDL'lerde dağıtılırken, plazma PL'nin %57'si HDL3'te bulunur.
Tavşanlara yüksek kolesterol diyeti ile meydan okunduğunda, hızla hiperkolesterolemi geliştiler. Lipoprotein profilleri VLDL'lerin belirgin yüksekliği ile karakterize edildi. Normal bir standart veya yüksek kolesterol diyeti ile beslenen vahşi tip tavşanlardan yedi lipoprotein fraksiyonu bir SDS poliakrilamid jel üzerinde çalıştırıldı ve CBB boyama ile görselleştirildi.
Yüksek kolesterol diyetinde, VLDL'lerdeki, IDL'lerdeki ve LDL'lerdeki ApoB-100 ve ApoE içerikleri belirgin şekilde yükseldi. Batı şişkinliği, üç farklı hiperlipidemik tavşanın apolipoproteinlerini ve lipoprotein profillerini karşılaştırmak için kullanıldı: yüksek kolesterol diyeti ile beslenen yabani tip tavşanlar, ApoE nakavt tavşanları ve LDL reseptör eksikliği olan Watanabe Kalıtsal Hiperlipidemik tavşanlar. Yüksek kolesterol diyeti ile beslenen yabani tip tavşan parçacıkları içeren ApoB, artan ApoB-100 ve ApoE içeriği ile karakterize edilirken, ApoE nakavt tavşanları ApoA-1 görünümü ile birlikte ApoB-48'in bir artışını göstermiştir.
Watanabe Heritable Hiperlipidemik tavşanlar LDL reseptör fonksiyonlarında genetik olarak eksiktir, bu nedenle insan ailesel hiperkolesterolemi hastalarına benzer şekilde, HDL'lerde ApoA-1'in azalması eşliğinde LDL'lerde belirgin bir ApoB-100 artışı gözlenmiştir. Örnek kurtarma bu yordamda en kritik olanıdır. Numune kaybını en aza indirmek için, fraksiyonu toplamaya ve alt fraksiyondaki viskoz yağışı tamamen çözmeye dikkat edilmelidir.
Yedi lipoprotein fraksiyonunun toplanmasından sonra, sıralama için diyaliz gerekir. Diyaliz tamamlandıktan sonra, lipoproteinler SDS sayfası, batı şişkinliği ve hücre bazlı çalışma kullanılarak analiz için örnekler. Klinik ortamda, ultrasantrifüjasyon genellikle lipoproteinleri dört fraksiyona ayırır.
Mevcut yöntem, hiperlipidemi araştırması için lipoproteinlerin daha fazla ayrıntısını sağlayan yedi lipoprotein fraksiyonunu izole edebilir.
